沙紅，王燕飛，高文偉，曲延英，張立明

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊830091，2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊830052）

甜菜離子注入誘變高糖性狀的QTL分析

沙紅1，王燕飛1，高文偉2，曲延英2，張立明1

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊830091，2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊830052）

利用離子注入誘變突變體高糖材料S10與中糖F104構(gòu)建高糖F2群體，通過800條RAPD，20對SSR引物的篩選及F2群體63個(gè)單株田間性狀的調(diào)查，運(yùn)用Mapmaker/expversion3.0和QTL2.0軟件進(jìn)行高糖性狀QTL分析，獲得了包含16個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的7個(gè)連鎖群，覆蓋甜菜染色體總長度的418.9cM，確定了3個(gè)與甜菜高糖性狀相關(guān)的QTL位點(diǎn)。

甜菜；高糖；RAPD和SSR；QTL

甜菜是我國北方重要的糖料作物。與世界甜菜種植先進(jìn)國家相比，我國甜菜單產(chǎn)、含糖率相對較低，選育優(yōu)良高產(chǎn)高糖甜菜品種是解決問題的根本途徑[1，2］。分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)在現(xiàn)代農(nóng)作物育種中得到廣泛應(yīng)用，尤其是水稻、棉花等。而目前，分子育種在甜菜育種剛起步。本試驗(yàn)是在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所朱小平、王燕飛等同志的工作基礎(chǔ)上進(jìn)行更深一步的研究[3］。

1 材料和方法

1.1 群體構(gòu)建

離子注入誘變高糖突變體材料S10，中糖F104互為母本，配置雜交組合，F(xiàn)1自交獲得F2群體。

1.2 DNA提取與RAPD和SSR標(biāo)記分析

1.2.1 DNA提取與純化改良SDS法，詳參考沙紅等人[4］。

1.2.2 RAPD和SSR標(biāo)記分析800條RAPD隨機(jī)引物和20對SSR引物對親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，用親本間有差異的SSR引物對F2群體的所有單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測。甜菜RAPD反應(yīng)體系為25μL反應(yīng)液中：10×Buffer（100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L KCl，80mmol/L（NH4）2SO4，0.5%NP-40）2.5μL；2.5mmol/L Mg2+；0.3mmol/L dNDPs；1U Taq酶；引物0.3μM；DNA模板30～50ng。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；94℃變性lmin，37℃退火lmin，72℃延伸2min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。采用1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓3.5v/cm。溴乙錠染色[3］。SSR擴(kuò)增體系為10μL的PCR反應(yīng)體系含：10×Buffer（20mmol/L MgSO4，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L KCl，80mmol/L（NH4）2SO4，0.5%NP-40）0.8μL；0.8mM dNTPs；0.5U Taq酶；模板DNA30ng；1nM引物并上覆的礦物油。PCR反應(yīng)程序：94℃3min；94℃1min，57℃1min，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在用8%的PAGE電泳檢測。

1.3 性狀考察及QTL定位

1.3.1 性狀考察高糖F2群體作一年生栽培，10月20日單株檢糖。

1.3.2 QTL定位用Mapmaker/expversion3.0進(jìn)行連鎖圖的構(gòu)建和QTL2.0軟件作高糖性狀QTL2.0定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD和SSR標(biāo)記多態(tài)性篩選

RAPD標(biāo)記800條引物出現(xiàn)穩(wěn)定的特異性只有173條。不同引物擴(kuò)增出的譜帶數(shù)差異較大。SSR標(biāo)記中20對引物有10對在兩親本間存在差異，表現(xiàn)出多態(tài)性，且擴(kuò)增條帶多，清晰，多態(tài)性好。在親本之間表現(xiàn)出多態(tài)性。擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量在300～3000bp，主要集中在500～2000bp。經(jīng)多次重復(fù)，確定19條RAPD引物和6對SSR引物對甜菜高糖親本S10，中糖親本F104及其F2代63株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.2 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

2.2.1 基于F2群體連鎖圖譜構(gòu)建RAPD和SSR標(biāo)記的偏分離分析25個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中，來源于父本的位點(diǎn)數(shù)為12個(gè)，來源于母本的位點(diǎn)數(shù)為13個(gè)。X2適合性測驗(yàn)表明，在25個(gè)RAPD標(biāo)記中，有9個(gè)標(biāo)記為偏分離標(biāo)記。利用Mapmaker/expversion3.0軟件設(shè)置最小LOD值為3.0和最大重組率為50cM，初步構(gòu)建了1個(gè)包括7個(gè)連鎖群16個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的甜菜分子連鎖圖譜，16個(gè)RAPD和SSR標(biāo)記，覆蓋甜菜染色體總長度的418.9cM，標(biāo)記間平均圖距為19.9cM。根據(jù)連鎖群的長度，由大到小依次將7個(gè)連鎖群命名為Lg1～Lg7。在21個(gè)標(biāo)記中，標(biāo)記在連鎖群上分布不均勻，標(biāo)記最多的只有6個(gè)標(biāo)記，最少的只有2個(gè)標(biāo)記。

2.2.2 區(qū)間作圖法結(jié)合考察田間檢糖結(jié)果，用MAPMAKER/QTL VERSION 1.1b程序進(jìn)行區(qū)間作圖法的QTL定位，取LOG值為3.0，確定與高糖性狀相關(guān)的QTL位點(diǎn)3個(gè)，見表1和圖1。

SC1-1 QTL位點(diǎn)位于ssr13-2～ssr13-4之間，加性效應(yīng)為1.77，顯性效應(yīng)為0.36。

SC1-2位點(diǎn)位于ssr13-4～ssr11-1之間，加性效應(yīng)為1.83，顯性效應(yīng)為0.45。

SC2位點(diǎn)位于ssr11-2～ssr4之間，加性效應(yīng)為1.37，顯性效應(yīng)為0.47。

3 討論

表1 F2群體區(qū)間作圖QTL定位結(jié)果（LOD>3.0）

圖1 利用F2群體構(gòu)建的7個(gè)分子標(biāo)記連鎖圖譜

3.1 利用RAPD和SSR標(biāo)記多態(tài)性篩選

在試驗(yàn)中利用800條引物RAPD標(biāo)記對兩親本擴(kuò)增，出現(xiàn)穩(wěn)定的特異性只有173條，不同引物擴(kuò)增出的譜帶數(shù)差異較大；而SSR標(biāo)記中20對引物有10對在兩親本間存在差異，表現(xiàn)出多態(tài)性。說明在本試驗(yàn)中RAPD標(biāo)記特異性較SSR差，其主要原因可能是：RAPD標(biāo)記相對要求模板DNA質(zhì)量高，同時(shí)受RAPD本身重復(fù)性、穩(wěn)定性的限制，從而影響擴(kuò)增條帶多態(tài)性和特異性。

3.2 分子標(biāo)記群體的構(gòu)建

甜菜為兩年生大樣本異花授粉作物，同時(shí)甜菜染色體復(fù)雜、倍性多樣，構(gòu)建標(biāo)記群體難度大。在分子標(biāo)記群體構(gòu)建中對群體數(shù)量有一定的要求，以保證所有的遺傳信息得到充分的表達(dá)，從而獲得與性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記位點(diǎn)。本試驗(yàn)中最終符合要求的F2群體63株，這對位點(diǎn)的確定和與性狀連鎖的緊密程度略有影響。

[1］王燕飛，董心久，張立明，等.再談新疆甜菜生產(chǎn)和含糖率[J］.中國糖料，2009（3）:69-71.

[2］盧秉福，韓衛(wèi)平，祁勇.甜菜種植比較效益分析[J］.中國糖料，2009（3）:39-41.

[3］朱小平，王燕飛，沙紅，等.甜菜離子注入誘變高糖突變體的RAPD分子標(biāo)記篩選[J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，45（2）：313-316.

[4］沙紅，王燕飛，曲延英，等.一種適于甜菜RAPD分析的DNA快速提取方法[J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，42（3）：162-164.

QTL Analysis of Impregnating Ion into High-sugar Mutant Sugarbeet

SHA Hong1,WANG Yan-fei1,GAO Wen-wei2，QU Yan-ying2，ZHANG Li-ming1
(1.Institute of Industrial Crops,Xinjiang Academy of Agriculture Sciences,Urumchi 830091,China; 2.College of Agriculture,Xinjiang Agriculture University,Urumchi 830052,China）

S10 is one of the parents as high sugar content mutant induced from ion impregnation,and F104 is as mid-sugar contentin this experimentin Xinjiang.Based on the 800 RAPD,20 pair makers and information of 63 plants from F2populations,the data were analyzed by strips using Mapmaker/expversion3.0 and QTL2.0.The results showed that seven Linkage pedigree of 16 molecular marks,covering 418.9cM of sugarbeet chromosome length,three QTLs were detected and linked to high sugar content（at the levelof LOD＞3）.

Sugarbeet;High sugar content;RAPD and SSR;QTL

S566.3；Q78

A

1007-2624（2010）03-0027-02

2010-03-18

新疆維吾爾自治區(qū)科技廳“十一五”攻關(guān)項(xiàng)目（200631103）。

沙紅（1974-），女，江蘇省啟東縣人，助理研究員，主要從事植物生物技術(shù)與分子生物學(xué)研究。

王燕飛（1955-），女，江蘇省啟東縣人，研究員，研究方向：甜菜和油料作物育種與栽培。E-mail:yanfeidj@xaas.ac.cn