孫 超,時(shí)會(huì)云,袁東朋

(東?？h人民醫(yī)院胸外科,江蘇 東海 222300)

化療是肺癌非手術(shù)治療的一線選擇,研究證實(shí)以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是治療進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的基本方案,但有效率亦僅 25%-30%,化療反應(yīng)率低與腫瘤細(xì)胞對(duì)聯(lián)合化療產(chǎn)生原發(fā)或繼發(fā)性耐藥有關(guān)[1]。隨著對(duì)腫瘤發(fā)生及聯(lián)合化療分子機(jī)制的認(rèn)識(shí),已證實(shí)一些腫瘤分子標(biāo)志的改變與化療敏感性有關(guān),如:P-糖蛋白 (P-glycoprotein,P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白 (Multidrug resis-tance-associated protein,MRP)、肺耐藥相關(guān)蛋白(Lung resistance-associated protein,LRP)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferase-pi,GST-π)等多種耐藥相關(guān)的酶和蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn)p53基因異常也在腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生中扮演了重要角色[2]。p53基因是影響細(xì)胞周期阻滯和凋亡過程的重要分子事件,細(xì)胞周期和凋亡異常又與腫瘤耐藥密切相關(guān)。本研究旨在總結(jié)突變型 p53蛋白和 4種耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,以明確肺癌細(xì)胞中 p53突變與化療耐藥性產(chǎn)生的相關(guān)性,了解其表達(dá)的一般規(guī)律和特點(diǎn),為臨床個(gè)體化選用合理的化療藥物提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料來源 60例 NSCLC組織均取自2003年 5月至 2009年 10月在我院經(jīng)纖維氣管鏡活檢或手術(shù)切除肺癌組織?；顧z前均未行全身及局部化療和放療,活檢后均根據(jù)不同的病理類型給予化療。其中男 39例,女 21例;年齡 30-71歲,平均 53歲。其中鱗癌 41例,腺癌 19例。分化程度:高分化20例,中分化 23例,低分化 17例。TNM分期:Ⅰ -Ⅱb期 9例,Ⅲ a期 12例,Ⅲ b期 13例,Ⅳ期 26例。根據(jù)胸部 CT檢查,有縱隔淋巴結(jié)腫大者 27例,無腫大者 33例。所有患者術(shù)后或活檢后均接受至少兩個(gè)周期的化療,化療結(jié)束后 5-7 d拍胸片,觀察化療效果并評(píng)定療效。療效根據(jù) WHO標(biāo)準(zhǔn)確定,達(dá)完全緩解或部分緩解者為療效有效,穩(wěn)定或進(jìn)展者為療效無效。取患者健側(cè)相應(yīng)部位的支氣管黏膜為對(duì)照。

1.2 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定 鼠抗人P-gp、MRP、LRP、GST-π、突變型 p53單克隆抗體及 SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑試劑盒,均購(gòu)于北京中杉生物技術(shù)開發(fā)公司。免疫組化染色:標(biāo)本均經(jīng) 10%中性甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,4μm連續(xù)切片,50℃恒溫箱中固定脫水 24 h,梯度二甲苯脫蠟水化,其余步驟按照 SP免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹膠固封。使用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照,用 PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。P-gp表達(dá)位于細(xì)胞膜,MRP、LRP、GST-π表達(dá)均位于細(xì)胞膜和∕或細(xì)胞漿,p53表達(dá)位于細(xì)胞核,陽(yáng)性反應(yīng)為棕黃色顆粒;每張切片在高倍鏡下(×400)隨機(jī)計(jì)數(shù) 10個(gè)視野,計(jì)算其陽(yáng)性率。判斷標(biāo)準(zhǔn):整張切片均無著色或偶有淺黃色細(xì)胞但陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) ＜5%為陰性(-),10%-25%為陽(yáng)性(+),25%-75%為(++),＞75%為(+++);耐藥基因相關(guān)蛋白陽(yáng)性表示腫瘤對(duì)該耐藥基因所介導(dǎo)的藥物具有耐受性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析相關(guān)數(shù)據(jù),P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺癌組織各基因的表達(dá)情況 P-gp在癌細(xì)胞的細(xì)胞膜呈彌漫性表達(dá),MRP、LRP、GST-π在肺癌組織的細(xì)胞膜和∕或細(xì)胞漿呈彌漫性或灶性分布,p53則在細(xì)胞核呈陽(yáng)性表達(dá)。具體結(jié)果見表1。

表1顯示:(1)60例 NSCLC中 P-gp陽(yáng)性表達(dá)32例(53.3%),MRP陽(yáng) 性 表 達(dá) 30例(50.0%),LRP陽(yáng)性表達(dá) 45例(75.0%),GST-π陽(yáng)性表達(dá) 44例 (73.3%),p53陽(yáng)性表達(dá) 41例 (68.3%)。(2)LRP在腺癌中表達(dá)最高,p53在鱗癌中表達(dá)最高,P-gp、MRP1和 GST-π在腺癌與鱗癌中表達(dá)率相差不大。x2檢驗(yàn)分析表明,P-gp的表達(dá)為腺癌 ＞鱗癌,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);MRP的表達(dá)為鱗癌 ＞腺癌,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);GST-π的表達(dá)腺癌和鱗癌相當(dāng),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);LRP的表達(dá)為腺癌 ＞鱗癌,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);p53的表達(dá)為鱗癌 ＞腺癌,差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。(3)突變型 p53的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化程度相關(guān),其表達(dá)隨著腫瘤分化程度的升高而呈遞減趨勢(shì),高分化組 p53的表達(dá)明顯低于中、低分化組(P＜0.05)。其余 4種耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)與腫瘤的分化程度無顯著相關(guān)性(P＞0.05)。(4)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者p53表達(dá)水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),且 p53表達(dá)與腫瘤 TNM分期相關(guān),肺癌從Ⅰ期到Ⅳ期,其表達(dá)逐漸升高。其余 4種蛋白在不同 TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 P-gp、MRP、LRP、GST-π和 p 53蛋白在 NSCLC中的表達(dá)[例(%)]

2.2 p53及耐藥相關(guān)蛋白的共表達(dá)現(xiàn)象 60例中有 p53和一種或一種以上耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)陽(yáng)性,表達(dá)率達(dá) 94.8%,其中 21例 4種耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)均為陽(yáng)性,表達(dá)率達(dá) 35.0%。p53與 P-gp、GST-π間的表達(dá)有相關(guān)性,Spearman等級(jí)相關(guān)分析也顯示 p53與 P-gp、GST-π的表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05),表達(dá)率分別為 71.2%和 51.7%。p53與LRP、MRP的表達(dá)無明顯相關(guān)性(P＞0.05),見表 2。

表2 p53蛋白與各耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的相關(guān)性

2.3 p53及耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)與 NSCLC臨床化療療效的關(guān)系 患者均接受含鉑化療方案,以EP、MVP、NP方案為主,總有效率為 56.67%(34/60),本研究中 60例患者均有完整隨訪資料,生存期計(jì)算自化療或手術(shù)首日始至死亡或失訪日止。中位隨訪時(shí)間為 35個(gè)月,其中 39例死亡。p53蛋白的表達(dá)與化療療效顯著相關(guān),p53陰性化療有效率為60.5%,p53陽(yáng)性化療有效率只有 28.3%(P＜0.05)。部分患者雖然 p53蛋白表達(dá)陰性,但化療效果不明顯,分析原因?yàn)檫@部分患者有 P-gp、MRP、LRP、GST-π基因一種或多種共表達(dá),致其對(duì)含鉑方案不敏感。p53陽(yáng)性表達(dá)者不同化療方案有效率分別為 EP 22%,MVP 27%,NP 33%,x2檢驗(yàn)顯示,與不同化療方案之間 p53蛋白的表達(dá)無顯著相關(guān)(P均 ＞0.05)。

3 討 論

腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性是目前抗腫瘤化療失敗的主要原因之一。產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細(xì)胞不僅對(duì)使用過的抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥,而且對(duì)多種未曾用藥物治療的腫瘤和作用機(jī)理不同的藥物也產(chǎn)生耐藥,這種現(xiàn)象稱為多藥耐藥性(Multi drug resistance,MDR)。事實(shí)上,腫瘤化療的耐藥性常常是多種耐藥蛋白參與及不同機(jī)制共同作用的結(jié)果。多藥耐藥基因是一個(gè)大家族,研究比較肯定的有 P-gp、MRP、LRP、GST-π、Topo-Ⅱ等,其中 P-gp被認(rèn)為是介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥的最主要機(jī)制[1-2]。有研究認(rèn)為,MDR基因的過度表達(dá)除了腫瘤進(jìn)展過程中腫瘤細(xì)胞自身產(chǎn)生外,還與體內(nèi)有害物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的長(zhǎng)期刺激、化療藥物誘導(dǎo)以及多種基因調(diào)節(jié)效應(yīng)有關(guān)[3]。最近研究表明,許多臨床常用的腫瘤化療藥物均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,凋亡可能是多數(shù)化療藥物細(xì)胞毒作用的最終共同途徑,而參與凋亡過程調(diào)控的 p53、Bcl-2等基因的表達(dá)失控可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物耐受[4]。隨著肺癌 MDR研究的擴(kuò)展和深入,人們?cè)絹碓蕉嗟仃P(guān)注到細(xì)胞凋亡相關(guān)基因在 MDR中的作用。

野生型 p53基因作為一種抑癌基因,在細(xì)胞周期的調(diào)控和誘導(dǎo)凋亡中起重要作用,Chin等[5]認(rèn)為,突變后的 p53可能會(huì)激活 MDR-1基因的啟動(dòng)因子,誘導(dǎo) MDR-1基因的復(fù)制,使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性大大降低。本研究中,p53與 P-gp、GST-π的表達(dá)存在明顯相關(guān)性。p53蛋白的積聚作為NSCLC患者化療的負(fù)相關(guān)性預(yù)后指標(biāo),提示腫瘤細(xì)胞中 p53蛋白的狀態(tài)同樣是對(duì)化療反應(yīng)一個(gè)頗為重要的因素。

本研究結(jié)果顯示,60例 NSCLC中 P-gp陽(yáng)性表達(dá) 32例(53.3%),MRP陽(yáng) 性 表 達(dá) 30例(50.0%),LRP陽(yáng)性表達(dá) 45例(75.0%),GST-π陽(yáng)性表達(dá) 44例 (73.3%),p53陽(yáng)性表達(dá) 41例 (68.3%),提示p53及 4種耐藥相關(guān)蛋白中肺癌組織中高表達(dá)導(dǎo)致腫瘤組織的耐藥,這與有關(guān)報(bào)道相符[6]。同時(shí) LRP和 P-gp在腺癌中表達(dá)要高于鱗癌,臨床上鱗癌比腺癌對(duì)化療敏感,而腺癌對(duì)化療存在普遍耐藥性亦與本結(jié)果相符;MRP和 GST-π的表達(dá)在腺癌和鱗癌無明顯差異 (P＞0.05)。p53在鱗癌中表達(dá)顯著高于腺癌,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);且 p53的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化程度及 TNM分期相關(guān),其表達(dá)隨著腫瘤分化程度的升高而呈遞減趨勢(shì),肺癌從Ⅰ期到Ⅳ期,其表達(dá)也是逐漸升高的。

60例中有p53和一種或一種以上耐藥相關(guān)蛋白共表達(dá)率達(dá) 94.8%,其中 21例 4種耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)均為陽(yáng)性,共表達(dá)率達(dá) 35.0%?；颊呋熞?EP、MVP、NP方案為主,總有效率為 56.67%,p53蛋白的表達(dá)與化療療效顯著相關(guān),p53陰性者化療有效率(60.5%)明顯高于 p53陽(yáng)性者(28.3%)。部分患者雖然 p53蛋白表達(dá)陰性,但化療效果不理想,分析其原因可能為這部分患者有 P-gp、MRP、LRP、GST-π基因一種或多種共表達(dá),致其對(duì)含鉑方案不敏感。這表明 P-gp、MRP、LRP、GST-π不同程度地同時(shí)參與了腫瘤的耐藥形成,表達(dá)上的差異性與不一致性也正說明了影響腫瘤耐藥機(jī)制的多因素性。因此,聯(lián)合檢測(cè)腫瘤多個(gè)耐藥相關(guān)標(biāo)志,同時(shí)評(píng)估多個(gè)耐藥基因的表達(dá),能更加客觀地反映腫瘤的耐藥情況。臨床上可依據(jù)耐藥機(jī)制的不同,篩選出產(chǎn)生耐藥可能性最小的聯(lián)合化療方案,優(yōu)化組合,增強(qiáng)療效。

目前臨床醫(yī)師制定化療方案一般根據(jù)經(jīng)驗(yàn)用藥或參考教科書,具有盲目性和不科學(xué)性。從本研究結(jié)果可看出,耐藥基因在不同個(gè)體中表達(dá)有很大差異,結(jié)合耐藥基因蛋白的作用機(jī)制與化療藥物的作用特點(diǎn),針對(duì)個(gè)人選擇敏感的化療藥物是十分必要的。例如,順鉑是現(xiàn)今臨床上肺癌化療方案中必不可少的一線藥物,但不同肺癌患者 P-gp、MRP、LRP、GST-π等的表達(dá)卻不盡相同,如果按部就班使用傳統(tǒng)的化療方案,結(jié)果將不能高效地殺死腫瘤細(xì)胞,同時(shí)這也解釋了臨床上同一方案化療效果的不一致性。因此化療前綜合檢測(cè)患者腫瘤組織的p53及耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)情況意義更大[7]:一方面,揭示腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)的分子機(jī)制,估計(jì)化療效果和判斷預(yù)后;另一方面,依據(jù)其固有耐藥機(jī)制來指導(dǎo)化療,制定有效的個(gè)體化療方案;再者,可依據(jù)耐藥機(jī)制的不同,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)劑增強(qiáng)化療療效,提高非小細(xì)胞肺癌患者的有效生存期。野生型 p53基因替代治療并聯(lián)合化療可能是增強(qiáng)肺癌化療療效的有希望途徑。多種化療藥物敏感實(shí)驗(yàn)、p53基因突變及多種耐藥基因表達(dá)的檢測(cè),對(duì)于化療效果的預(yù)測(cè)、個(gè)體化化療方案的制定具有重要的意義。

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