李文英,傅萬海,陳國新,梁 劍

(1.廣東省第二人民醫(yī)院兒科,廣東 廣州 510317;2.廣州市天河區(qū)中醫(yī)院兒科,廣東 廣州 510655)

人輪狀病毒(Human Rotavirus,HRV)感染引起兒童腹瀉常發(fā)生在秋冬季,發(fā)病率高,傳染性強(qiáng),病情兇險(xiǎn),是發(fā)展中國家小兒死亡的主要疾病。目前全世界還未發(fā)現(xiàn)特效的治療藥物,僅限于補(bǔ)液和調(diào)節(jié)酸堿平衡,但效果皆不盡人意。中醫(yī)方面也有口服驗(yàn)方治療該病的報(bào)導(dǎo),但嬰幼兒存在口服中藥的困難,特別是伴有嘔吐和中重度脫水的患兒更難吸收。我們自 2002年以來,在臨床上靜脈使用參芪扶正注射液配合常規(guī)補(bǔ)液治療輪狀病毒感染性腹瀉取得了較顯著的療效。為了從理論角度明確參芪扶正注射液對輪狀病毒腸道感染后機(jī)體免疫功能的影響,我們在 2008年 11月至 2009年 8月間進(jìn)行了相關(guān)動物實(shí)驗(yàn),以小鼠 HRV感染模型研究了參芪扶正注射液治療輪狀病毒感染時機(jī)體免疫功能的變化,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下:

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及病毒 BLAB/C健康小鼠 80只,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、病毒唑組和參芪扶正注射液治療組,每組各 20只。實(shí)驗(yàn)前所有小鼠大便RV抗原經(jīng)膠體金法檢測呈陰性。HRV細(xì)胞懸液,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 參芪扶正注射液成份為黃芪、黨參,由麗珠集團(tuán)利民制藥廠生產(chǎn),每瓶 250 ml。病毒唑?yàn)閺V東江門制藥廠產(chǎn)品,100 mg/ml(批號:000706)。糞便 HRV抗原檢測試劑盒由上海名碘生物工程公司提供;IL-2、IFN-γ檢測試劑盒由深圳晶美生物工程有限公司提供。

1.3 感染造模 除正常對照組外均按 Schoub[1]方法將滴度為 4.4×105pfu/只 0.1 ml HRV懸液經(jīng)口感染小鼠。正常對照組給等量生理鹽水(NS)。病毒接種后,各組隔離飼養(yǎng)觀察。12 h后收集每只小鼠糞便。

1.4 判斷小鼠是否感染輪狀病毒 病毒接種后 1-4 d摩腹收集小鼠大便,放入 EP管于 -80℃保存?zhèn)溆?膠體金法檢測 RV抗原。

1.5 給藥方式 其中參芪扶正注射液治療組用極細(xì)小尼綸管經(jīng)口滴入?yún)④畏稣⑸湟?0.1 ml/(只?次),3次/d,連續(xù)給藥 7 d。病毒唑組用同樣方法滴入病毒唑,0.1 ml/(只?次),3次/d,正常組與模型組均滴入等量細(xì)胞培養(yǎng)液,連續(xù) 7 d。

1.6 臨床觀察及標(biāo)本的留取 每天觀察記錄各組動物的臨床表現(xiàn)(大便性狀、小鼠的精神狀態(tài)、毛色、采食狀況和體重等)。在末次給藥后 24 h各組隨機(jī)抽取 12只小鼠,每只斷頸留血約 0.5 ml,放置于清潔的肝素鈉抗凝管內(nèi),搖勻,將血液以 4 000 r/min的速度離心 15 min,取血清,-20℃保存?zhèn)溆?。同時解剖小鼠,留取肝臟、脾臟、腎臟及小腸,10%甲醛固定待檢。

1.7 檢測項(xiàng)目

1.7.1 組織病理學(xué)檢測 各臟器用 10%甲醛固定、脫水、包埋、切片和蘇木素 -伊紅染色后行病理學(xué)檢查。

1.7.2 IL-2、IFN-γ表達(dá)的測定 采用雙抗體夾心 ELISA法檢測小鼠血清中 IL-2、IFN-γ的表達(dá),具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各組數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,用 SPSS13.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。全部數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性分析后,采用單因素方差分析和 t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床表現(xiàn) 所有感染組小鼠在接毒后第 2天均出現(xiàn)明顯的腹瀉癥狀(大便軟、灘不成形,稀便或水樣便),第 3-4天癥狀達(dá)到高峰,后逐漸恢復(fù),至第 7天癥狀有不同程度的消失。正常對照組保持正常情形,體毛平順,食欲正常,精神活躍,體重正常。

2.2 大便 RV抗原檢測 治療前除正常對照組以外所有小鼠大便 RV抗原檢測均呈強(qiáng)陽性。在治療第 4天,檢測各組糞便 RV情況,模型組均陽性(20/20),病毒唑組陽性 11只(11/20),參芪組陽性2只(2/20),正常對照組均陰性(0/20),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,參芪組陽性率明顯低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);且低于病毒唑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 組織病理學(xué)改變 感染組可見小腸上皮變性脫落,腸絨毛變平,萎縮,腎小體和腎小管上皮輕度空泡變性,其他組織器官未見明顯改變。正常對照組各器官未見明顯改變。

2.4 血清中 IL-2、IFN-γ的表達(dá)情況 參芪治療組血清 IL-2含量顯著高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與正常對照組比較差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。參芪治療組 INF-γ表達(dá)含量高于模型組及正常對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但與病毒唑組比較差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表 1。

表1 參芪扶正注射液對 HRV感染小鼠IL-2、INF-γ表達(dá)的影響(x±s)

3 討 論

參芪扶正注射液是采用我國傳統(tǒng)補(bǔ)氣藥物黨參、黃芪為主要原料精制而成的純中藥制劑,具有扶正固本、補(bǔ)脾益氣之功效。參芪并用具有較好的扶正功效及免疫調(diào)節(jié)作用[2]。

許多研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子在 RV感染引起的腸道內(nèi)、外感染發(fā)病中起重要作用,在 RV感染早期,細(xì)胞免疫應(yīng)答以 Th1反應(yīng)為特征,Th1應(yīng)答優(yōu)勢往往引起感染的痊愈[3],以介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答為主的 Th1細(xì)胞主要分泌 IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子,其中 IL-2主要由活化的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能最主要的淋巴因子之一[4]。IL-2能激活多種免疫細(xì)胞,誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的增生與免疫效應(yīng),促進(jìn) B細(xì)胞的免疫應(yīng)答以及 NK細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞的增生[5]。INF-γ是活化的 T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有多潛能的細(xì)胞因子,對免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用,它不僅能激活巨噬細(xì)胞,還能活化 NK細(xì)胞,而 NK細(xì)胞是構(gòu)成免疫防御第一道防線的非特異性殺傷細(xì)胞,因此 IFN-γ的釋放在 RV感染的急性期起保護(hù)性作用[6]。

從本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以認(rèn)為參芪扶正注射液能夠改善輪狀病毒感染小鼠的腹瀉癥狀,該作用可能通過兩個方面的藥理作用完成,一方面參芪扶正注射液抑制輪狀病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制從而減少病毒感染導(dǎo)致的腹瀉;另一方面經(jīng)參芪扶正注射液治療后小鼠血清 IL-2和 INF-γ含量有顯著增高,表明參芪扶正注射液可以增強(qiáng)輪狀病毒感染小鼠的免疫功能,可能是由促進(jìn)小鼠 Th1細(xì)胞活化所致,當(dāng)然其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述,參芪扶正注射液在抑制輪狀病毒復(fù)制的同時能提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能,使病毒感染所致的細(xì)胞免疫水平下降及細(xì)胞免疫功能損傷得到較快的恢復(fù),因此臨床上可應(yīng)用于輪狀病毒感染且免疫功能低下患兒的治療。

[1] Schoub BD,Progesky DW.Antiviral Activity of Ribavirin in Rotavirus Gastroemteritis of Mice,Antimicr[J].Agen and Chemotr,1997,12∶543.

[2] 耿維鳳,陳 敏.參芪扶正注射液臨床初步觀察[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2003,23(9)∶554.

[3] 徐 錦,楊 毅,孫家娥,等.急性輪狀病毒性腹瀉患兒免疫應(yīng)答的觀察[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2006,26(3)∶248-251.

[4] Azevedo M,Yuan L,Pouly S,et al.Cytokine responses in gnotobiotic pigs after infection with virulent or attenuated human rotavirus[J].Jvirology,2006,80(1)∶372-382.

[5] Kim JW,Ferris RL,Whiteside TL.Chemokine C Receptor Expression and Protection of Circulating CD8+T Lymphocytes from Apoptosis[J].Clin Cancer Res,2005,11(21)∶7 901-7 910.

[6] Sugata K,Taniguchi K,Yui A,et al.Analysis of rotavirus antigenemia and extra-intestinal manifestations in children with rotavirus gastroenteritis[J].Pediatrics,2008,122(2)∶392-397.