戴克勝

北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院血液與細胞生物學(xué)實驗室,北京,100191

目的:血小板在血栓形成,尤其是動脈和微血管血栓形成過程中起主要作用。血小板表面主要粘附受體-膜糖蛋白(GP)Ibα與受損傷血管表面血管性血友病因子(vWF)的結(jié)合是血小板參與血栓形成、止血的起始、關(guān)鍵步驟。本研究的目的是探討血小板主要粘附受體在血小板凋亡及血栓形成負反饋機制中的作用,并探討其相關(guān)機制。方法:取健康志愿者外周抗凝靜脈血,分離純化血小板。通過瑞斯托霉素(Ristocetin)或剪切力作用誘導(dǎo)GPIbα與vWF特異性結(jié)合;采用流式細胞術(shù)、Western-blotting分別檢測線粒體和胞質(zhì)凋亡標(biāo)志物、凋亡調(diào)控蛋白、Bax、Bak和Bcl-2的表達,以及血小板膜表面GPIbα的表達量以及GPIbαN端和C端的酶切情況。構(gòu)建表達野生型GPIbα、突變型GPIbα-552(不含GPIb alpha-552氨基酸以后的C-末端序列)和GPIbα-609(609位絲氨酸被丙氨酸替代)CHO細胞株,Ristocetin誘導(dǎo)細胞與vWF的結(jié)合,用流式細胞術(shù)和Western-blotting檢測凋亡標(biāo)志物及凋亡調(diào)控蛋白的表達。結(jié)果:在Ristocetin和高剪切力作用下GPIbα和vWF結(jié)合可誘導(dǎo)血小板發(fā)生凋亡(包括線粒體內(nèi)膜電位的降低、磷脂酰絲氨酸的外翻、骨架蛋白gelsolin的酶切),促凋亡蛋白Bax和Bak高表達以及GPIbα胞外部分酶切;而在生理性剪切力作用下,GPIbα和vWF結(jié)合只可誘導(dǎo)GPIbα的酶切,不能引起血小板凋亡反應(yīng)。血小板活化抑制劑PGE1和apyrase不能抑制GPIbα/vWF誘導(dǎo)的血小板凋亡和GPIbα酶切。此外,在 Ristocetin作用下,與GPIbα野生型細胞株相比,兩株突變型細胞株呈凋亡陰性。抑制GPIbα胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和信號蛋白14-3-3結(jié)合的多肽可顯著抑制GPIbα和vWF結(jié)合誘導(dǎo)的血小板凋亡的發(fā)生。結(jié)論:在生理和病理條件下,血小板GPIbα與vWF的結(jié)合除了能夠誘導(dǎo)血小板粘附、血栓形成以外,還可以誘導(dǎo)血小板凋亡和GPIbα酶切。凋亡過程受GPIbα胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和信號蛋白14-3-3結(jié)合的調(diào)控,這一發(fā)現(xiàn)為揭示血栓性血小板減少性紫癜(T TP)等疾病的發(fā)病機制提供了全新思路。而流體剪切力作用下GPIbα與vWF相互作用可導(dǎo)致GPIbα酶切的發(fā)現(xiàn),提示血小板具有自身負反饋調(diào)節(jié)機制,可阻止血栓的無限制增大。以上發(fā)現(xiàn)對認識體內(nèi)血栓形成與調(diào)控機制、探討疾病發(fā)病機理以及新的預(yù)防治療措施具有重要意義。