李瓊，吳淑燕，黃瑞

蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院病原生物學(xué)系，蘇州 215123

自噬(autophagy)的發(fā)現(xiàn)已有較長(zhǎng)歷史，但成為目前研究熱點(diǎn)的根本原因是人們發(fā)現(xiàn)其在高等生物中的存在也是一種基本生命現(xiàn)象，與細(xì)胞惡變、機(jī)體炎癥、生老病死和長(zhǎng)壽等密切相關(guān)。自噬在機(jī)體的免疫、感染、炎癥、腫瘤、心血管病、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病中具有十分重要的作用，是當(dāng)今生命科學(xué)繼凋亡(apoptosis)后最熱的研究領(lǐng)域之一。細(xì)胞自噬在機(jī)體固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用，一方面通過(guò)溶酶體清除胞質(zhì)內(nèi)微生物，發(fā)揮天然抗感染免疫作用；另一方面可通過(guò)調(diào)節(jié)抗原呈遞，在獲得性免疫反應(yīng)中發(fā)揮效應(yīng)。本文綜述了近年來(lái)自噬在抗原加工、呈遞中作用的研究進(jìn)展。

1 自噬與抗原呈遞

自噬由Ashford和Porten在1962年首先發(fā)現(xiàn)，指來(lái)源于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無(wú)核糖體附著區(qū)的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需要降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(autophagosome)，然后與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，降解所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新[1]。根據(jù)底物進(jìn)入溶酶體途徑的不同，可將自噬分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)3類[2]。目前普遍認(rèn)為自噬是一種防御和應(yīng)激調(diào)控機(jī)制，適度的自噬對(duì)及時(shí)清除多余或損傷的細(xì)胞器、穩(wěn)定細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)、維持細(xì)胞的正常功能和避免細(xì)胞衰老等至關(guān)重要。它既是體內(nèi)的 “廢品回收站”，也是“垃圾處理廠”；既可抵御病原體的入侵，又可保衛(wèi)細(xì)胞免受細(xì)胞內(nèi)毒物的損傷。自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種“自食”(self-eating)，而凋亡則是細(xì)胞的“自殺”(self-killing)，兩者共用相同的刺激因素和調(diào)節(jié)蛋白，但誘發(fā)閾值和門檻不同，如何轉(zhuǎn)換和協(xié)調(diào)目前還不清楚。一般說(shuō)來(lái)，凋亡是程序化細(xì)胞死亡，自噬是程序化細(xì)胞存活，但過(guò)多或過(guò)少的自噬卻危害細(xì)胞。在某些情況下，自噬可引起細(xì)胞死亡，因此早期也稱自噬為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡。自噬通常發(fā)生在細(xì)胞處于壓力情況下，如饑餓、去除細(xì)胞因子等，此過(guò)程涉及自噬體的形成。自噬檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”是通過(guò)電子顯微鏡看到膜狀結(jié)構(gòu)的自噬體及其他相關(guān)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。最常用的方法是蛋白免疫印跡檢測(cè)自噬標(biāo)志物——微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β(microtubule-associated protein 1 light chain 3β，MAP1 LC3β)中LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換，還可用熒光顯微鏡檢測(cè)LC3點(diǎn)狀聚集物的形成。由于LC3本身最終經(jīng)溶酶體降解，因此需要應(yīng)用一些溶酶體抑制劑聯(lián)合檢測(cè)。此外，2009年還發(fā)現(xiàn)存在非LC3依賴性途徑的自噬[3]。

與在壓力條件下為保證細(xì)胞存活非選擇性攝取胞質(zhì)成分而獲得能量不同，免疫活化狀態(tài)下的自噬具有特異性，在固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。絕大多數(shù)抗原進(jìn)入機(jī)體后，需經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)加工和處理，由主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)分子呈遞給T細(xì)胞以激活獲得性免疫。經(jīng)典的MHC分子有2類：MHCⅠ類和MHC Ⅱ類分子。MHCⅠ類分子主要呈遞通過(guò)蛋白酶體降解的產(chǎn)物——短壽的胞質(zhì)、胞核蛋白和細(xì)胞器，如細(xì)胞周期素、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等；而MHCⅡ類分子主要呈遞通過(guò)溶酶體降解的產(chǎn)物。一般情況下，MHCⅠ類分子呈遞內(nèi)源性抗原，MHCⅡ類分子呈遞外源性抗原。然而對(duì)MHCⅡ類分子-抗原肽復(fù)合物的研究發(fā)現(xiàn)，有相當(dāng)部分的MHCⅡ類配體來(lái)源于胞質(zhì)蛋白，甚至胞核蛋白，無(wú)法用經(jīng)典的MHCⅡ類分子呈遞外源性抗原來(lái)解釋。最近研究發(fā)現(xiàn)，自噬參與了這種將胞質(zhì)成分傳遞到內(nèi)體和溶酶體的過(guò)程。

2 自噬與MHCⅡ類分子對(duì)抗原的加工和呈遞

自噬對(duì)抗原呈遞的重要作用主要表現(xiàn)在增強(qiáng)MHCⅡ類分子對(duì)抗原的呈遞及對(duì)CD4+T細(xì)胞的活化。3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)是目前已知最常見胞質(zhì)來(lái)源的天然MHC Ⅱ類分子配體，可通過(guò)CMA降解，并能在自噬發(fā)生后存在于自噬體內(nèi)[4]。GAPDH已在5種不同的MHCⅡ類等位基因的編碼產(chǎn)物中分離到，而在MHCⅠ類中卻從未發(fā)現(xiàn)，提示自噬底物負(fù)載至MHCⅡ類分子，由MHCⅡ類分子呈遞。在樹突細(xì)胞(dendritic cell，DC)、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等能表達(dá)MHCⅡ類分子的專職性APC中，自噬蛋白8(autophagy protein 8，Atg8)或LC3(酵母的Atg8在哺乳動(dòng)物中為L(zhǎng)C3)與MHCⅡ類分子在結(jié)構(gòu)上有50%～80%的重疊性，表明自噬參與了將抗原呈遞給MHCⅡ類分子，由其加工后呈遞至T細(xì)胞而引發(fā)獲得性免疫反應(yīng)[5]。用RNA干擾(RNA interference，RNAi)抑制自噬或抑制與自噬體形成相關(guān)的蛋白，MHCⅡ類分子呈遞抗原的能力明顯下降[6]。用自噬體標(biāo)記蛋白研究模式抗原與MHCⅡ類分子的結(jié)合及呈遞過(guò)程發(fā)現(xiàn)，自噬可使負(fù)載Atg8/LC3-流感病毒基質(zhì)蛋白和Atg8/LC3-腫瘤抗原融合蛋白的MHCⅡ類分子呈遞抗原的能力增強(qiáng)5～20倍[7]?？乖呐c突變型Atg8/LC3的融合蛋白不能增強(qiáng)抗原呈遞作用。

細(xì)胞生物學(xué)研究為自噬參與MHCⅡ類分子處理內(nèi)源性抗原肽的過(guò)程提供了有力證據(jù)。MHCⅡ類分子負(fù)載發(fā)生在晚期內(nèi)體富含MHCⅡ類分子的腔隙(MHC class Ⅱ-containing compartment，MⅡC)，此時(shí)MⅡC具有多泡或多層形態(tài)，提示其與表現(xiàn)為多層膜結(jié)構(gòu)的自噬體之間存在某種重要的聯(lián)系。應(yīng)用免疫電子顯微鏡，以膠體金作為標(biāo)記物，觀察到內(nèi)體與自噬體的融合。當(dāng)溶酶體降解被抑制時(shí)，該融合體保持穩(wěn)定。通過(guò)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)與自噬蛋白的融合物GFP-Atg8/LC3標(biāo)記自噬體，發(fā)現(xiàn)GFP-Atg8/LC3和MHCⅡ類分子相鄰定位于囊泡內(nèi)膜上，是MHCⅡ類分子負(fù)載抗原肽與自噬體共定位的重要 證 據(jù)[8]。在土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)感染的巨噬細(xì)胞囊泡中，可觀察到GFP-Atg8/LC3與MHCⅡ類分子共定位，進(jìn)一步提供了自噬體和MⅡC融合的證據(jù)[9]。因此，自噬參與MHCⅡ類抗原呈遞的過(guò)程為：自噬體與MⅡC融合→傳遞底物至晚期內(nèi)體的囊泡膜→提供MHCⅡ類分子負(fù)載。

自噬對(duì)抗原呈遞的重要作用除增強(qiáng)MHCⅡ類分子呈遞和CD4+T細(xì)胞活化外，對(duì)于某些病原體還是必不可少的。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)蛋白85B抗原是預(yù)防分枝桿菌感染的一種重要候選疫苗抗原[10]。西羅莫司(rapamycin，RAPA)是誘導(dǎo)自噬的經(jīng)典藥物，激活自噬后能增強(qiáng)85B抗原與MHCⅡ類分子的結(jié)合，此過(guò)程需要活的結(jié)核分枝桿菌感染，并可被RNAi所致的atg6基因沉默所抑制。在感染的巨噬細(xì)胞中，RAPA可將結(jié)核分枝桿菌定位于自噬體中，并能增強(qiáng)體內(nèi)被結(jié)核分枝桿菌感染的DC活化，從而刺激85B抗原誘導(dǎo)的特異CD4+T細(xì)胞活化，證明自噬參與了MHC Ⅱ類分子對(duì)抗原的呈遞。EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)為人類皰疹病毒，95%以上的成人呈隱性感染。在機(jī)體免疫力低下時(shí)，病毒會(huì)導(dǎo)致咽炎、上呼吸道感染和傳染性單核細(xì)胞增多癥等，并與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。EBV核抗原1(EBV nuclear antigen 1，EBNA-l)具有甘氨酸-丙氨酸(Gly-Ala)重復(fù)序列，可抑制蛋白酶體對(duì)病毒的作用，從而逃脫CD8+T細(xì)胞識(shí)別，但可被CD4+T細(xì)胞識(shí)別。在自噬過(guò)程中，EBNA-1抗原肽被降解后與溶酶體中的MHCⅡ類分子結(jié)合，呈遞到APC表面以激活機(jī)體的抗病毒特異免疫應(yīng)答[11]。在EBV感染細(xì)胞中，溶酶體酶的活性被抑制后，EBNA-l主要存在于胞質(zhì)，只有小部分存在于溶酶體中。單磺酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)是一種熒光染料，可用作自噬泡的示蹤劑[12]。MDC染色發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)中的EBNA-1與MDC重合；電子顯微鏡觀察到EBNA-l被雙層膜包裹，說(shuō)明EBNA-l被自噬泡捕獲后傳遞至溶酶體。抑制溶酶體的酸化過(guò)程或RNAi將atg12沉默，均可阻斷EBNA-1的MHCⅡ類抗原呈遞和CD4+T細(xì)胞克隆的形成[13]。以上實(shí)驗(yàn)反向說(shuō)明，通過(guò)自噬傳遞了病原體的特異抗原，以供MHCⅡ類分子加工、呈遞，并活化CD4+T細(xì)胞，從而啟動(dòng)機(jī)體的獲得性免疫應(yīng)答。

對(duì)自噬在內(nèi)源性MHCⅡ類分子抗原呈遞中的研究主要集中于經(jīng)典APC，如巨噬細(xì)胞、DC和B細(xì)胞等，但自噬在非專職性APC中對(duì)抗原呈遞也有作用。小鼠胸腺上皮細(xì)胞吞噬能力較低，但與胸腺細(xì)胞的陽(yáng)性選擇密切相關(guān)，其中存在的大量自噬可能參與了胞核和胞質(zhì)中自身蛋白的處理以供MHCⅡ類分子負(fù)載[14]。此外，細(xì)胞自噬還可增強(qiáng)疫苗效果，如流行性感冒病毒抗原與自噬體膜表面蛋白LC3結(jié)合后，比單用抗原刺激引起更強(qiáng)烈的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)。自噬還能將胞質(zhì)中復(fù)制病毒的中間產(chǎn)物呈遞給含有Toll 樣受體7(Toll-like receptor 7，TLR7)的內(nèi)體以激活干擾素α(interferon α，IFN-α)，通過(guò)TLR7活化自噬[15]。

3 自噬與MHC Ⅰ類分子對(duì)抗原的加工和呈遞

大量研究已證實(shí)，自噬主要參與MHC Ⅱ類分子對(duì)抗原的呈遞，也可在經(jīng)典和非經(jīng)典MHCⅠ類分子的抗原呈遞中起輔助作用。感染單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus 1，HSV-1)的巨噬細(xì)胞中，除經(jīng)典的病毒多肽- MHCⅠ類分子復(fù)合體呈遞抗原外，自噬也參與其中。HSV-1糖蛋白B在自噬體內(nèi)被蛋白酶體降解后，與MHCⅠ類分子形成的復(fù)合體被呈遞，進(jìn)而激活CD8+T細(xì)胞。MHCⅠ類分子主要呈遞內(nèi)源性抗原，但如果APC自身不能處理抗原則從外界捕獲并與MHCⅠ類分子結(jié)合后呈遞給T細(xì)胞，此方式稱交叉呈遞(cross presentation)。最近研究發(fā)現(xiàn)吞噬細(xì)胞中MHCⅠ類和Ⅱ類分子交叉呈遞抗原的過(guò)程——對(duì)死亡細(xì)胞的清除，精確地依賴于瀕死細(xì)胞發(fā)揮自噬功能[6]。atg5和atg6缺陷細(xì)胞不能產(chǎn)生凋亡小體，不會(huì)被吞噬細(xì)胞吞噬，且不能釋放溶血磷脂膽堿而募集巨噬細(xì)胞。這導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育中不完整腔隙形成，凋亡細(xì)胞在atg5缺陷小鼠體內(nèi)蓄積。此外，在雞視網(wǎng)膜發(fā)育中，用3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)抑制自噬也會(huì)導(dǎo)致壞死細(xì)胞蓄積[16]。在小鼠中，自噬產(chǎn)生的ATP參與磷脂酰絲氨酸的表面呈遞，同時(shí)為鄰近細(xì)胞有效吞噬凋亡小體提供能量。因此，自噬通過(guò)促進(jìn)吞噬細(xì)胞攝取瀕死細(xì)胞，增強(qiáng)MHCⅠ類和MHCⅡ類分子的交叉呈遞。

除參與經(jīng)典的MHC分子對(duì)抗原的加工、呈遞外，自噬還可直接傳遞病原體成分至溶酶體，使其降解并被免疫系統(tǒng)識(shí)別。它可能是通過(guò)促進(jìn)病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)被細(xì)胞TLR識(shí)別來(lái)完成的。此外，非經(jīng)典MHCⅠ類分子CD1d可在MⅡC獲得其糖脂配體[17]。自噬體通常與MⅡC融合，溶酶體的水解作用還可對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行處理，因此自噬可能通過(guò)傳遞糖脂配體給CD1d分子，隨后被呈遞給自然殺傷(natural killer, NK)T細(xì)胞，即能組成性表達(dá)NK1.1和TCR-CD3復(fù)合受體分子的T細(xì)胞，激活免疫反應(yīng)。

4 結(jié)語(yǔ)

細(xì)胞自噬參與機(jī)體抵御病原體入侵的免疫防御過(guò)程，也是機(jī)體對(duì)抗病原體感染的第2道防線。研究發(fā)現(xiàn)，在人扁桃體炎和咽喉炎發(fā)作時(shí)，免疫系統(tǒng)有時(shí)無(wú)法抵擋病原菌入侵細(xì)胞，但一旦啟動(dòng)細(xì)胞自噬就能消滅這類細(xì)菌。深入探討自噬在抗原加工、呈遞中的作用機(jī)制，有助于闡明病原體的感染過(guò)程，最終為人類通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬預(yù)防和控制感染的發(fā)生、發(fā)展提供新的思路和方法。

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