楊長永,陳傳波,陶德定,黃 丹,龔建平

1)河南大學公共衛(wèi)生研究所開封 475004 2)華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院腫瘤研究所武漢 430030△男,1978年生,碩士,講師,研究方向:腫瘤分子生物學,E-mail:yangchangyong52@yahoo.com.cn

細胞凋亡是一種細胞周期事件[1]。細胞凋亡的細胞周期特異性即是處于不同細胞周期時相的細胞同時受到同樣的“打擊”,細胞均在細胞周期中的某一特定點走向凋亡[2]。細胞凋亡的途徑主要有 2條:一條是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活Caspase;另一條是通過胞外信號激活細胞內(nèi)的凋亡酶Caspase,即膜受體途徑?；罨腃aspase可將細胞內(nèi)的重要蛋白降解,引起細胞凋亡。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是典型的膜受體途徑的細胞凋亡誘導劑。該實驗中作者采用TNF-α誘導不同細胞凋亡,建立合理、穩(wěn)定的膜受體途徑的凋亡模型,并通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的周期特異性。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 T淋巴細胞型白血病細胞株Molt-4與Jurkat購自武漢大學典型物保藏中心,外周血淋巴細胞(PBL)取自健康志愿者,均知情同意。異硫氰酸熒光素(FITC)標記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)與植物血凝素(PHA)購自晶美公司, TNF-α為英國 EC公司產(chǎn)品,淋巴細胞分離液為中科院血液所產(chǎn)品,FACSort流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng) Molt-4與Jurkat細胞接種于體積分數(shù)10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、0.1 kg/L鏈霉素以及2mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基, 37℃、體積分數(shù) 5%CO2條件下培養(yǎng)。用淋巴細胞分離液通過密度梯度離心(2 000 r/min 20 min)分離PBL,重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基,調(diào)整細胞濃度為3×105mL-1,加入終濃度為10 mg/L的PHA,置細胞培養(yǎng)箱中,37℃、體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng);對照組不加PHA。

1.3 細胞處理 取對數(shù)生長期的Molt-4與Jurkat (3×105mL-1)和加入PHA刺激的PBL(3×105m L-1),分別加入50μg/L TNF-α,培養(yǎng)6、12、18、24與36 h收獲細胞。

1.4 細胞凋亡及細胞凋亡周期特異性檢測 常規(guī)膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)/碘化丙啶(PI)法檢測細胞凋亡:細胞離心去除培養(yǎng)基,以預冷(4℃)的結(jié)合緩沖液洗滌細胞,調(diào)整細胞濃度為 1×106mL-1,取100μL細胞加入Annexin V-FITC 5μL和PI 10μL,室溫避光反應15min后流式細胞儀檢測,CellQuest軟件(BD公司)獲取并分析數(shù)據(jù)。

API法檢測細胞凋亡周期特異性[3]:收獲細胞加入5μL Annexin V-FITC后,室溫避光反應30 min,以預冷的結(jié)合緩沖液洗滌1次,加入1m L不含甲醇的體積分數(shù)1%的甲醛,冰上固定30min后,結(jié)合緩沖液洗滌2次,加入0.5mL PI染液[50mg/L PI,500mg/L洋地黃皂甙,10 mmol1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES),2 mmol CaCl2,0.1 mol NaCl],1 h后流式細胞儀檢測。

細胞周期蛋白(Cyclin)/DNA雙參數(shù)流式細胞術(shù)檢測細胞周期特異性的始動位點:培養(yǎng)細胞收獲后,用體積分數(shù) 80%冷乙醇固定,置于-20℃冰箱過夜,固定后的細胞用 PBS洗滌 2次,然后用體積分數(shù)0.25%TritonX-100在冰上處理5m in,以PBS洗滌2次,然后加入用體積分數(shù)1%BSA稀釋的鼠抗人Cyclin E抗體(美國BD公司)0.25μg,4℃孵育過夜。次日細胞用PBS洗滌后,加入標有FITC的羊抗鼠IgG抗體(Sigma公司)(用體積分數(shù)1% BSA以體積比 1∶40的比例稀釋),在室溫下孵育30min。再次洗滌細胞后,用10 mg/L PI和1 g/L RNase A(Sigma公司)在室溫下進行DNA染色20 min,采用流式細胞術(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 Annexin V/PI法檢測細胞凋亡 對數(shù)生長期的Molt-4、Jurkat和加入PHA刺激的PBL加入TNF-α后,分別在 18、24和 24 h出現(xiàn)了較為明顯的細胞凋亡。以早期細胞凋亡為主,凋亡率為 8%～18%。圖1以Molt-4細胞為例說明。

2.2 API方法檢測細胞凋亡的周期特異性 TNF-α誘導的Molt-4、Jurkat和PHA刺激的PBL的細胞凋亡發(fā)生在G1期,維持周期特異性細胞凋亡的時間點分別為18、24和24 h。TNF-α誘導時間過短凋亡不明顯,時間過長出現(xiàn)了其他細胞周期的凋亡細胞。圖2以Molt-4細胞為例說明。

2.3 Cyclin/DNA雙參數(shù)流式細胞術(shù)檢測周期特異性細胞凋亡的始動位點 TNF-α誘導的Molt-4、Jurkat和PHA刺激的PBL的周期特異性細胞凋亡的始動位點在細胞周期的G1早期。圖3以PBL為例說明。

3 討論

流式細胞術(shù)作為分子生物學的重要技術(shù)與方法,已成為研究細胞周期和細胞凋亡的重要手段。在過去的研究中,人們探索出了多種檢測細胞凋亡的方法。如傳統(tǒng)的Annexin V/PI法,但這種方法只能顯示細胞凋亡率,不能直觀而準確地顯示細胞凋亡的周期特異性。該實驗通過API法將細胞凋亡與細胞周期的檢測緊密地聯(lián)系在一起。這種方法使用的是非同步化的培養(yǎng)細胞,細胞總是處于細胞周期中。有研究[4]表明細胞周期可以更為詳盡地分為 6期(G0期、G1早期、G1晚期、S期、G2期以及M期),而API方法只能按傳統(tǒng)的細胞周期三分法進行細胞凋亡的周期特異性定位,不能更精確地顯示周期特異性凋亡的始動位點。Cyclin/DNA雙參數(shù)流式細胞術(shù)很好地解決了這一難題。Cyclins是一類呈細胞周期特異性表達﹑累積與分解的蛋白質(zhì),通過時相性激活細胞周期依賴性蛋白激酶驅(qū)動細胞周期的進行[5-6]。Cyclins的表達具有時相性[7]。Cyclin/ DNA雙參數(shù)流式細胞術(shù)將單個細胞中Cyclin E的表達情況和細胞在細胞周期中所處的位置結(jié)合起來,對細胞周期進行較為詳盡的區(qū)分。Cyclin E在G1早期合成,在細胞進入 S期時達到最高,并于細胞通過S期時逐漸被降解[8-9]。在Cyclin/DNA雙參數(shù)流式細胞術(shù)的二維等高圖中,G0期細胞不表達Cyclin E,G1早期細胞Cyclin E為弱陽性而G1晚期細胞為強陽性,將 G1期分為G1早期和G1晚期,同時將G0期與G1期分開。根據(jù)人類Cyclin E的表達模式圖[4],該實驗結(jié)果顯示膜受體介導的細胞凋亡Cyclin E的表達降低,細胞被阻滯在G1早期而走向凋亡。

綜上所述,Cyclin/DNA雙參數(shù)流式細胞術(shù)可以精確而直觀地反映受體途徑的細胞凋亡與細胞周期的關(guān)系,從而為針對性地研究G1早期的細胞周期調(diào)控事件在凋亡過程中的作用提供良好的平臺;為膜受體途徑的細胞凋亡在腫瘤形成、生物治療、自身免疫性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病發(fā)生中的作用提供理論指導。這一方法的實施中需要注意:不同細胞的周期特異性凋亡的最佳時間點不同,這可能與細胞膜的受體表達量有關(guān),作用時間過長,過多的細胞碎片和代謝產(chǎn)物影響培養(yǎng)環(huán)境,如出現(xiàn)旁觀者效應而影響結(jié)果的分析[10];可通過Annexin V/PI法選擇最佳的凋亡時間點獲得最穩(wěn)定的凋亡模型,從而顯示出典型的周期特異性。

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