陳裕生 肖幼林

COX-2、bFGF在前列腺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性實驗研究

陳裕生 肖幼林

目的研究COX-2及bFGF在前列腺癌組織中的表達(dá)，在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。方法應(yīng)用免疫組化SP法檢測正常前列腺(NP)、良性前列腺增生(BPH)、前列腺癌(PCa)組織中COX-2和bFGF蛋白表達(dá)。結(jié)果(1)在NP組中COX-2表達(dá)0%，在BPH組中為8.70%，在PCa組中72.41%(P＜0.01)。bFGF陽性表達(dá)率依次增高(P＜0.01)。(2)COX-2在PCa組中表達(dá)率為72.41%；bFGF在Pca組中為81.03%，與腫瘤的分級無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，與腫瘤臨床分期密切相關(guān)(P＜0.05)。COX-2、bFGF在PCa中存在正性相關(guān)(r=0.786，P＜0.01)。結(jié)論(1)COX-2與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。檢測COX-2蛋白表達(dá)可以協(xié)助PCa的病理分級、臨床分期。(2)bFGF的表達(dá)是PCa的惡性表型。(3)COX-2的增加可上調(diào)bFGF的表達(dá)而促進(jìn)血管生成和腫瘤的發(fā)展。

免疫組織化學(xué)；前列腺癌；COX-2；bFGF

前列腺癌是一種老年人多發(fā)的惡性腫瘤，死亡率僅次于肺癌。隨著人民平均壽命的增長、醫(yī)療保健措施的改善及生活質(zhì)量的提高，我國前列腺癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1-2]，且惡性程度較高、預(yù)后差。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與多種因素異常表達(dá)有關(guān)。研究相關(guān)生物因子的異常表達(dá)對研究相關(guān)病變具有一定的臨床意義。COX-2和BFGF與腫瘤的關(guān)系密切，聯(lián)合研究二者在前列腺組織中的表達(dá)及相互關(guān)系可能對前列腺癌的診斷和治療具有重要作用。COX-2是xie等于1991年分離發(fā)現(xiàn)的。COX-2是一種誘導(dǎo)型表達(dá)蛋白，主要表達(dá)于核膜，被認(rèn)為是“快速反應(yīng)基因”，在正常生理狀態(tài)下多數(shù)組織內(nèi)檢測不到，當(dāng)細(xì)胞接受相應(yīng)刺激后便快速合成表達(dá)，參與炎癥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等多種病理生理過程。bFGF于1974年由Gospodarowicz等首次分離并純化該物質(zhì)，bFGF的基因定位于染色體46q26-27，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA有多個拼切位點及翻譯起始位點，由此產(chǎn)生多種分子量的bFGF，分子量為18KD的bFGF最常見，bFGF主要定位于胞核中。

1 材料和方法

1.1 材料 隨機(jī)選取中南大學(xué)附屬第一醫(yī)院、中南大學(xué)附屬第二醫(yī)院、湖南省第二人民醫(yī)院2002年3月～2007年7月泌尿外科住院患者，共計58例，年齡59～82歲，平均65.4歲，期間行前列腺手術(shù)或經(jīng)直腸穿刺并經(jīng)病理確診為前列腺癌(均為腺癌)，所有病例術(shù)前均未行內(nèi)分泌治療、放療和化療。所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林溶液固定常規(guī)石蠟包埋后存檔，標(biāo)本過小、臨床資料不全不作研究，前列腺癌標(biāo)本病理分級按Gleason評分標(biāo)準(zhǔn)2～4分為高分化癌16例，5～7分為中分化癌20例，8～10分為低分化癌22例。臨床分期按Whitmore-Jewett標(biāo)準(zhǔn)A期14例、B期12例、C期21例、D期11例。

1.2 試劑 即用型兔抗人COX-2多克隆抗體、即用型超敏免疫組織化學(xué)SP試劑盒、即用型DAB顯色劑、多聚賴氨酸等均購自福州邁新生物試劑公司。檸檬酸鹽緩沖液配制劑。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 將石蠟切片脫蠟，3%過氧化氫溶液孵育20min，消除內(nèi)源性過氧化物酶。微波修復(fù)，正常兔血清進(jìn)行封閉，將封閉血清甩掉，滴加1：40的一抗，在37℃溫箱中孵育2h。滴加二抗，在37℃溫箱中孵育15min。DAB顯色2～5min，蘇木素復(fù)染30s，脫水，透明，封片。染色結(jié)果：按半定量積分法，即以染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)百分比綜合計分作定性分析[3]COX-2和BFGF的蛋白表達(dá)。所有陽性染色為棕黃色，以胞漿、胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性細(xì)胞標(biāo)志。染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特性(染色深淺需與背景著色相對比)計分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分比即高倍視野(400×)隨機(jī)觀察某類細(xì)胞3～5個視野，計算100個間質(zhì)細(xì)胞或癌細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)平均值：陰性為0分，陽性細(xì)胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積0～2分為陰性，記作“－”；3～12分為陽性，記作“＋”。

2 結(jié)果

見表1。結(jié)果顯示：(1)在NP組中COX-2蛋白沒有表達(dá)，在BPH組中陽性表達(dá)率為8.70%，在PCa組中陽性表達(dá)率為72.41%，P＜0.01。bFGF在NP、BPH、PCa組中陽性表達(dá)率分別為0%、63.04%、81.03%。(2)COX-2在PCa組中陽性表達(dá)率為72.41%，與腫瘤的分級、分期密切相關(guān)，隨病理分級、臨床分期升高陽性表達(dá)率升高(P＜0.01)，高分化組與中分化組間差異無顯著性(P＞0.05)，而高、中分化組與低分化組間差異有顯著性(P＜0.05)；bFGF在Pca組中陽性表達(dá)率為81.03%，與腫瘤的分級無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，但與腫瘤臨床分期密切相關(guān)(P＜0.05)。COX-2、bFGF兩種蛋白在PCa組織中的表達(dá)存在正性相關(guān)(r=0.786，P＜0.01)。(3)COX-2、bFGF在PCa淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組中陽性表達(dá)率分別為95.00%、100.00%；60.53%、71.05%，兩種蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.05)。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與多種因素異常表達(dá)有關(guān)。近幾年來，國內(nèi)外諸多研究表明，COX-2除了在炎癥等過程中發(fā)揮重要作用外，還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，成為腫瘤防治的一個新靶點。許多癌前病變和惡性腫瘤中都有COX-2的高表達(dá)，而血管的形成在腫瘤的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移過程中具有非常重要的作用。血管的形成受多種因素的影響，主要是受血管生成促進(jìn)因子和血管生成抑制因子的共同調(diào)控。bFGF是迄今發(fā)現(xiàn)的非常重要的促血管形成的多肽生長因子，具有強(qiáng)大的促血管生成作用，并能誘導(dǎo)增加血管的通透性及促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，與腫瘤生長、浸潤、轉(zhuǎn)移的發(fā)展過程極其密切。本實驗采用免疫組織化學(xué)SP法觀察COX-2和bFGF在前列腺癌組織中的表達(dá)情況，探討COX-2和bFGF在前列腺癌中的相關(guān)性，力圖對前列腺癌在分子水平上進(jìn)行腫瘤的早期臨床診斷、治療及判斷預(yù)后開辟一條新的途徑。

我們采用免疫組化方法檢測了正常前列腺、良性前列腺增生和前列腺癌組織中COX-2蛋白的表達(dá)情況，分別為0%、8.70%、72.41%，證實了COX-2在正常前列腺、良性前列腺增生組織中表達(dá)缺失或低表達(dá)。提示COX-2的異常表達(dá)在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的過程中起重要作用。我們的研究結(jié)果顯示，COX-2蛋白陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)、部分位于細(xì)胞膜。COX-2在前列腺癌高、中分化組與低分化組織中的陽性表達(dá)率逐漸升高，分別為56.25%、65.00%、90.91%，高、中分化組與低分化組組間差異性明顯；COX-2在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達(dá)率為95.00%，明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的60.53%；C、D期前列腺癌組織中COX-2的陽性表達(dá)率為84.38%，顯著高于A、B期的57.69%，提示COX-2的表達(dá)程度與前列腺癌的病理分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。COX-2可能通過以下機(jī)制加速腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。①COX-2的過度表達(dá)使血中PGE2增加，PGE2可抑制自然殺傷細(xì)胞NK、淋巴殺傷細(xì)胞LAK的活性，降低L-2受體和IFN-Y受體的表達(dá)，使免疫監(jiān)視功能下降、細(xì)胞殺傷力降低。②COX-2刺激細(xì)胞釋放血管源性前列腺素，促進(jìn)腫瘤血管的形成，為腫瘤血管形成創(chuàng)造條件。③Tsujii等發(fā)現(xiàn)COX-2過表達(dá)的細(xì)胞有許多改變，它以極大的活性與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白黏附，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移；表達(dá)低水平的TGFb2受體和E-鈣黏連素；抵抗細(xì)胞凋亡；表達(dá)高水平的Bcl-2蛋白。這些改變均可增加細(xì)胞致癌潛能。我們采用免疫組化方法檢測了正常前列腺、良性前列腺增生和前列腺癌組織中bFGF蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)表達(dá)率逐漸升高，分別為0、63.04%、81.03%，組間差異有顯著性意義。在高、中、低分化PCa組織中未發(fā)現(xiàn)bFGF的表達(dá)與腫瘤分化程度有相關(guān)性；C、D期前列腺癌組織中的陽性表達(dá)率為93.75%，顯著高于A、B期的65.38%；bFGF在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達(dá)率為100%，明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的71.05%，提示bFGF的表達(dá)與前列腺癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。bFGF的表達(dá)是PCa的惡性表型，bFGF的過表達(dá)與的前列腺癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，因此檢測bFGF的表達(dá)可以為判斷前列腺癌的進(jìn)展情況及預(yù)后提供依據(jù)。前列腺基質(zhì)和上皮細(xì)胞內(nèi)皆可分泌bFGF，但bFGF主要是通過基質(zhì)細(xì)胞上的受體促進(jìn)基質(zhì)的生長。在沒有雄激素或EGF(表皮生長因子)的情況下，bFGF能刺激前列腺癌細(xì)胞生長。雖然bFGF在前列腺癌發(fā)生中的作用尚不很清楚，但目前認(rèn)為bFGF表達(dá)的改變與前列腺癌向高侵襲性、低分化、轉(zhuǎn)移性癌的轉(zhuǎn)變有關(guān)。Nodo等發(fā)現(xiàn)bFGF對胃癌尤其是晚期胃癌的發(fā)展具有促進(jìn)作用。Miyake等在進(jìn)行膀胱癌細(xì)胞的抗藥性研究時，發(fā)現(xiàn)bFGF能保護(hù)癌細(xì)胞免遭藥物引起的順序死亡，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的抗藥性，bFGF除了對腫瘤細(xì)胞有促進(jìn)作用外，還通過刺激血管的形成及生長促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。體外實驗表明[4]bFGF在前列腺癌組織中的表達(dá)與分布明顯高于正常前列腺和BPH。由于bFGF能夠促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤細(xì)胞增殖，并且是重要的血管形成因子，因此前列腺癌組織中bFGF過度表達(dá)是腫瘤增殖的需要，也可能是前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的原因之一。Strohmeyer等對98例石蠟包埋的前列腺癌組織進(jìn)行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)癌旁正常組織bFGF呈低表達(dá)，而腫瘤組織呈高表達(dá)；我們的實驗發(fā)現(xiàn)，臨床分期越高，其陽性表達(dá)率越高。研究結(jié)果顯示，COX-2的表達(dá)與bFGF的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.786，P＜0.01)。前列腺癌組織中COX-2的表達(dá)與bFGF的表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)，提示它們在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到協(xié)同作用，共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但COX-2蛋白與bFGF之間如何相互作用，其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

表1 COX-2、bFGF在NP、BPH、PCa不同病理分級、臨床分期組織中的表達(dá)

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10.3969/j.issn.1009-4393.2010.14.030

410007 湖南省第二人民醫(yī)院 (陳裕生 肖幼林)