馬紅娜,鄧銜柏*,馬勇江,何 敏,習(xí)欠云,寧章勇,張桂紅,盧培成,張曼玉

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州510642;2.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院,廣東廣州510430;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,廣東廣州510642)

色氨酸羥化酶2(tryptophan hydroxylase 2,TPH-2)是色氨酸羥化酶的亞型之一,該基因優(yōu)先在腦干中表達(dá),負(fù)責(zé)合成中樞5-羥色胺(5-hydroxytryp tamine,5-HT),代表神經(jīng)性TPH基因[1]。TPH-2為中樞5-H T合成的限速酶,具有專一性,在組織中含量較低,且具有不穩(wěn)定性。TPH-2基因單核苷酸多態(tài)性與精神疾病有某種程度的聯(lián)系,目前國內(nèi)外有TPH-2基因單核苷酸多態(tài)性與抑郁癥及自殺行為研究的報(bào)道[2-5],對色氨酸羥化酶的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)。

應(yīng)激是動(dòng)物在生存過程中受到各種各樣刺激后產(chǎn)生的非特異性適應(yīng)性反應(yīng)。適度應(yīng)激可使機(jī)體度過短期惡劣環(huán)境,適應(yīng)能力得到提高,但強(qiáng)烈應(yīng)激可影響多種生理活動(dòng)和行為,長期應(yīng)激會使機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào),免疫力下降,引起胃腸道疾病,甚至不良精神變化。當(dāng)體內(nèi)受到心理、生理等刺激時(shí)可伴有腦內(nèi)5-HT合成及代謝的改變。在一般研究TPH的試驗(yàn)中,都會有驅(qū)趕動(dòng)物的可能。在豬的飼養(yǎng)管理過程中,常發(fā)生驅(qū)趕應(yīng)激的現(xiàn)象。這種驅(qū)趕應(yīng)激是否對延髓中的TPH-2有影響,所以本試驗(yàn)選擇比運(yùn)動(dòng)性疲勞溫和的驅(qū)趕應(yīng)激來研究中樞TPH-2的變化。

對于TPH-2的定性和定量,較常用的是免疫印跡、免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫沉淀方法[6]。但這些方法難以及時(shí)、快速地檢測到機(jī)體內(nèi)TPH-2的表達(dá)。鑒于此本試驗(yàn)擬采用RT-PCR技術(shù)對TPH-2進(jìn)行半定量檢測,建立半定量檢測TPH-2的表達(dá)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 試驗(yàn)所用的仔豬延髓組織采自廣州市增城區(qū)某豬場。分別選出相同日齡,體重相似的仔豬20頭,隨機(jī)分為兩組,一組為驅(qū)趕應(yīng)激組,一組為直接處死組,驅(qū)趕組驅(qū)趕應(yīng)激后立刻處死5頭,直接處死組直接處死5頭。

1.1.2 試劑和儀器 Trizol(Invitrogen),EXTaqDNA聚合酶寶生物工程(大連)有限公司,TaqDNA聚合酶寶生物工程(大連)有限公司,DL2000 Maker(TAKARA),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI),DEPC,溴化乙錠,瓊脂糖等試劑。低溫離心機(jī),超凈工作臺,核酸分析儀,PCR儀,凝膠成像儀,電泳儀。

1.2 方法

1.2.1 延髓組織RNA的提取

1.2.1.1 裂解 取約0.1 g延髓組織放入研缽內(nèi),在液氮中將組織充分研磨成粉狀后,倒入1.5 mL EP管中,加入1 mL T rizol溶液,充分振蕩混勻。室溫孵育10 min,4℃12 000 r/min離心5 min,棄沉淀。

1.2.1.2 分離 按1 mL T rizol加入200 μ L氯仿的比例加入RNA專用氯仿,劇烈振蕩15 s,冰上靜置2 min,4℃12 000 r/min離心15 min。

1.2.1.3 沉淀 取上清層到一個(gè)新1.5 mL EP管中,加入500 μ L RNA專用異丙醇,顛倒混勻,4℃孵育10 min,4℃12 000 r/min離心10 min。

1.2.1.4 洗滌 棄上清,向管中加入1 mL冰浴的750 mL/L乙醇洗滌沉淀,4℃7 500 r/min離心7 min,棄去上清。

1.2.1.5 溶解 RNA適度干燥后,用30 μ L無RNA酶水溶解。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量,核酸分析儀測量其濃度,以便在反轉(zhuǎn)錄的過程中進(jìn)行定量。若暫時(shí)不用,可保存在—70℃中。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,cDNA可直接用于PCR擴(kuò)增。

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)

1.2.3.1 引物序列 應(yīng)用Primer Premier5.0軟件,按照引物設(shè)計(jì)的基本要求,設(shè)計(jì)β-actin和TPH-2基因擴(kuò)增引物。β-actin和TPH-2基因擴(kuò)增長度分別為102 bp和398 bp。所有引物均由英俊公司合成,使用前將引物稀釋至10 mmol/L。

1.2.3.2 退火溫度 β-actin和TPH-2基因在其引物Tm±5℃的范圍內(nèi)設(shè)溫度梯度。兩對引物的Tm不同,需分別擴(kuò)增,篩選出各自最佳的退火溫度。

1.2.3.3 Mg2+濃度篩選 在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)條件下,選擇不同Mg2+濃度(分別為1.25、1.50、2、2.5、2.75 mmol/L)擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)產(chǎn)量和特異性,確定最適合的Mg2+濃度。

1.2.3.4 循環(huán)數(shù)確定 選擇適當(dāng)?shù)难h(huán)數(shù),使擴(kuò)增產(chǎn)物處在平臺期前的線性增長范圍內(nèi),并在瓊脂糖凝膠上清晰可見和定量。所檢測的目的RNA和內(nèi)標(biāo)β-actin最佳循環(huán)次數(shù)須在同一范圍?；騎PH-2和β-actin的PCR反應(yīng)體系為:2.5 μ L cDNA產(chǎn)物,0.5 μ L Taq酶,TPH-2基因(或β-actin基因)上下游引物各2 μ L,dNTP 4 μ L,5 μ L 10×buffer,MgCl2(25 mmol/L)待定,終體積50 μ L。反應(yīng)程序如下:94℃5 min;94℃30 s,退火溫度待定,30 s,72℃30 s(23、25、27、30、35個(gè)循環(huán));72℃7 min,4℃保存。

1.2.4 凝膠電泳、凝膠成像和定量分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物50 μ L與6×Loading buffer混勻,吸取6 μ L到20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,點(diǎn)上DL 2 000 Marker,以確定擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小。80 V電泳15 min,溴化乙錠(EB)染色,凝膠成像系統(tǒng)拍照,并用Gelpro凝膠分析軟件分析。結(jié)果用TPH-2基因和β-actin電泳帶IOD的比值表示。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 用SPSS10.0版統(tǒng)計(jì)軟件處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用配對t檢驗(yàn)和X2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 延髓組織總RNA的提取

采用Trizol法提取全部延髓組織總RNA。各取3 μ L,經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量,延髓組織總RNA的28 S rRNA、18 S rRNA條帶清晰明亮,無拖帶現(xiàn)象,且28 S rRNA的亮度是18 S rRNA的二倍,表明提取的RNA樣品較為完整,基本無降解。用核酸分析儀測定RNA的濃度,其OD260/OD280比值均在1.8～2.0,說明樣品的純度較高,定量后可用于后續(xù)的試驗(yàn)(圖1)。

圖1 總RNA提取結(jié)果Fig.1 The ex traction result of total RNA

2.2 退火溫度的確定

在進(jìn)行退火溫度梯度試驗(yàn)時(shí),將β-actin引物的溫度設(shè)置在38℃～52℃,β-actin目的片段長度為102 bp,TPH-2引物的溫度在40℃～50℃,目的片段為398 bp。經(jīng)過對PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果的分析得出,TPH-2基因片段擴(kuò)增的最佳退火溫度為45℃;內(nèi)參β-actin基因片段擴(kuò)增的最佳退火溫度為45℃(圖2)。

2.3 Mg2+濃度對擴(kuò)增效率的影響

Mg2+是影響Taq酶擴(kuò)增效率的重要因素,一般在1.25 mmol/L～2.75 mmol/L,但擴(kuò)增效率因序列不同而有不同。應(yīng)用分析軟件對電泳條帶IOD值進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn),在2 mmol/L時(shí)擴(kuò)增效率及特異性良好;Mg2+濃度在1.5 mmol/L～2.5 mmol/L時(shí)對β-actin基因特異性引物的擴(kuò)增效率影響不是很明顯。故試驗(yàn)選用2 mmol/L Mg2+濃度進(jìn)行TPH-2基因和β-actin基因的擴(kuò)增(圖3和圖4)。

圖2 TPH-2和β-actin退火溫度的確定Fig.2 Determination of Tm of TPH-2 and β-actin

圖3 不同Mg2+濃度下TPH-2 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoretic result of TPH-2 PCR product at different Mg2+concentration

圖4 不同M g2+濃度下β-actin產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoretic result of β-actin PCR product at different Mg2+concentration

2.4 PCR循環(huán)數(shù)的確定

為使半定量結(jié)果更加準(zhǔn)確,試驗(yàn)分別用5個(gè)不同循環(huán)數(shù)(23、25、27、30、35個(gè)循環(huán))對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,分析擴(kuò)增產(chǎn)物的20 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果,以條帶亮度作為選擇循環(huán)數(shù)的根據(jù)。從圖5可見TPH-2基因中30個(gè)和35個(gè)循環(huán)所得條帶亮度已基本一致,表明擴(kuò)增進(jìn)入平臺期,TPH-2基因在25個(gè)循環(huán)時(shí)擴(kuò)增的不同樣本cDNA,條帶明暗度有差異,可見此時(shí)處于線性增長期(圖6)。β-actin在27個(gè)循環(huán)時(shí)進(jìn)入平臺期,兩個(gè)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)需保持一致,因此確定25個(gè)循環(huán)為擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(圖7)。

2.5 RT-PCR結(jié)果

β-actin基因RT-PCR擴(kuò)增后20 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示各條帶亮度基本一致(圖8)。圖9為TPH-2基因RT-PCR擴(kuò)增后20 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果,可見條帶亮度有差異,可用來作為刺激對TPH-2基因表達(dá)的半定量檢驗(yàn)。

圖5 TPH-2擴(kuò)增循環(huán)數(shù)確定Fig.5 Determination of amplification cycles of TPH-2

圖6 TPH-2在25個(gè)循環(huán)時(shí)的擴(kuò)增 Fig.6 Amplification result of TPH-2 gene

圖7 β-actin擴(kuò)增循環(huán)數(shù)確定Fig.7 Determination of amplification cycles of β-actin

圖8 β-actin 20 g/L瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.8 Electrophorog ram of β-actin 20 g/L agarose

圖9 TPH-2 20 g/L瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.9 Electrophorogram of TPH-2 20 g/L agarose

2.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用Gelpro凝膠成像系統(tǒng)軟件分析得出β-actin、T PH-2基因PCR產(chǎn)物的灰度值,TPH-2的灰度值分別除以β-actin的灰度值,得出相對灰度值(表1)。

表1 TPH-2 mRNA在延髓組織及其驅(qū)趕應(yīng)激組織中表達(dá)量的差異Table 1 The diferences gene ex pressions of TPH-2 between none hustle stress and hustle stress

2.7 TPH-2及β-actin基因相對表達(dá)量與驅(qū)趕應(yīng)激的關(guān)系

半定量得出的相對灰度值,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析其結(jié)果為P＞0.05,TPH-2基因在兩組延髓組織中表達(dá)差異不顯著,灰度分析表明,TPH-2 mRNA在直接處死延髓組織及其配對驅(qū)趕應(yīng)激延髓組織中表達(dá)量有差異,TPH-2 mRNA在驅(qū)趕應(yīng)激的延髓組織中表達(dá)上調(diào)。表明驅(qū)趕應(yīng)激對TPH-2基因mRNA表達(dá)量的有影響但影響不顯著。

3 討論

3.1 關(guān)于TPH

TPH為5-H T合成的關(guān)鍵酶和限速酶,直接決定著神經(jīng)元內(nèi)5-HT的含量。5-HT又稱血清素(serotonin),它既是重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì),又是一種血管活性物質(zhì),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛,幾乎參與生物體所有的生理活動(dòng)和行為功能的調(diào)控,包括情感、認(rèn)知、感覺,以及內(nèi)分泌功能、胃腸道功能等。TPH的生理活性和表達(dá)水平的正常與否影響著5-H T的合成量,可以增強(qiáng)或減弱5-HT及其代謝物的作用強(qiáng)度,進(jìn)而影響它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能。TPH分為TPH-1及TPH-2,其中T PH-2對中樞5-HT的合成具有重要作用[7]。因而TPH-2基因也成為與5-HT功能紊亂相關(guān)的精神疾病遺傳學(xué)研究中的一個(gè)重要的候選基因,并日益受到關(guān)注及重視。

色氨酸羥化酶是5-H T合成的關(guān)鍵酶和限速酶,其活性和其合成速度直接決定著神經(jīng)元內(nèi)5-H T的含量。在此次試驗(yàn)中,色氨酸羥化酶轉(zhuǎn)錄有上調(diào)趨勢,5-HT有可能會增加,當(dāng)增加達(dá)一定程度時(shí)就會引起機(jī)體不適。中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT含量及功能異常可能導(dǎo)致嘔吐、引起精神病和偏頭痛等多種疾病。但5-HT、色氨酸羥化酶、嘔吐現(xiàn)象之間的聯(lián)系的報(bào)道很少,需進(jìn)一步研究證明。

3.2 有關(guān)TPH-2的RT-PCR檢測

在酶的表達(dá)分析中,常用的有實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Northern blot、免疫印跡、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀等定量技術(shù),但這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,費(fèi)用較高,且需要特殊儀器。半定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)因其費(fèi)用低、技術(shù)操作相對簡便、快速,近年來被廣泛地應(yīng)用于RNA表達(dá)研究中[8-11]。這種方法將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過測定PCR產(chǎn)物的量,可以推出各樣品中特異mRNA的相對含量。

雖然RT-PCR檢測快速簡單,但受很多因素影響[12]:①總RNA和cDNA的質(zhì)量,在用RT-PCR法來對mRNA進(jìn)行半定量時(shí),只有在總RNA未被降解的情況下,才能保證其中mRNA的完整性和反轉(zhuǎn)錄的cDNA的質(zhì)量,從而能夠真實(shí)的反映起始模板中基因表達(dá)量的差異。為達(dá)到這一要求,從采集樣本到反轉(zhuǎn)錄都要保證無RNA酶污染,盡量減少RNA的降解。檢測總RNA的完整性是必要的,濃度不高,完整性差的樣本盡量棄用,以免影響試驗(yàn)結(jié)果。有時(shí)為避免樣品中DNA殘留造成的假陽性的影響,在反轉(zhuǎn)錄時(shí),需用DNA酶消除殘存在樣品中的DNA。②引物的選擇,引物的好壞往往是PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵,做半定量檢測時(shí),引物特異性要高,否則會影響反應(yīng)結(jié)果。③PCR循環(huán)數(shù)的確定,PCR擴(kuò)增反應(yīng)是酶促反應(yīng),遵循酶促反應(yīng)定律。產(chǎn)物與模板有一個(gè)線性關(guān)系,RT-PCR技術(shù)就是利用這一點(diǎn)來對目的基因中mRNA表達(dá)進(jìn)行定量。表達(dá)豐度不同的基因半定量分析的PCR循環(huán)數(shù)不同。選擇合適的循環(huán)數(shù)不僅能使擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上清晰可見和定量,也可使擴(kuò)增反應(yīng)在到達(dá)平臺期前的線性范圍內(nèi)進(jìn)行,這樣半定量的結(jié)果就更加準(zhǔn)確。

總之,半定量RT-PCR是一種粗略地估計(jì)基因表達(dá)的相對變化的方法,若要精確地計(jì)算基因的表達(dá)量還需利用實(shí)時(shí)熒光PCR等技術(shù)方法。由于多數(shù)研究并不是檢測轉(zhuǎn)錄水平微小的變化或確切的表達(dá)量,而是檢測其表達(dá)水平變化差異是否顯著。所以,隨著該技術(shù)的日趨成熟與完善,半定量分析mRNA水平的方法將成為研究者的強(qiáng)有力的研究手段。在本試驗(yàn)中,TPH-2 mRNA在驅(qū)趕組和直接處死組的兩組延髓組織中表達(dá)差異不顯著,在驅(qū)趕應(yīng)激的延髓組織中表達(dá)上調(diào)。表明驅(qū)趕應(yīng)激對TPH-2基因mRNA表達(dá)量有影響但影響不顯著,為下一步對色氨酸羥化酶的研究提供依據(jù)和技術(shù)支持。

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