張業(yè)偉,孫 磊,嚴(yán)棟梁,劉允怡,王太洪

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇省腫瘤醫(yī)院普外科,江蘇南京,210009;2.南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科,江蘇南通,226300;3.香港中文大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬香港威爾斯親王醫(yī)院外科學(xué)系)

供者器官來源嚴(yán)重不足深深阻礙了和困擾著器官手術(shù)的推廣和應(yīng)用。隨著對異種移植的興趣和深入研究,跨物種的異種移植已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。異種1移植除了解決供移植器官來源的問題外,還可能避免人類病毒的感染(如HIV和肝炎病毒),因?yàn)閯游锝M織對人感染的病毒不感染,異種移植有可能今后用于治療新的傳染病,如心肌炎、病毒性肺炎或腎炎等。

本研究分別以正常和經(jīng)全身預(yù)處理(RIC)的貴州香豬為供者、中國獼猴為受體,建立異種肝移植模型。探討異種肝移植術(shù)后超急性排斥反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制;及探討受體靜脈輸注異種供體來源凋亡細(xì)胞能否抑制異種移植免疫排斥反應(yīng)及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康貴州香豬(雌雄不限,14.5～24.5 kg,由太倉育種豬廠提供)作為供體。中國獼猴(1月大,1～1.5 kg,雄性,由蘇州西山中科有限公司提供)作為受體。飼養(yǎng)條件符合無特定病原(SPF)動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)前禁食8 h、自由飲水,術(shù)后不給免疫抑制劑及抗生素,予單籠飼養(yǎng),自由攝食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)選用近交系的中國獼猴為受者和貴州香豬為供者,進(jìn)行原位肝臟移植。受者獼猴隨機(jī)分為A、B、C組,A組為正常對照組,n=6;B組為實(shí)驗(yàn)對照組,n=28,在接受RIC之后,再接受供者貴州香豬的異種異基因骨髓(BM)靜脈輸注;C組為實(shí)驗(yàn)組,n=36,在接受RIC之后,再接受供者貴州香豬的BM和凋亡細(xì)胞同時(shí)靜脈輸注。

手術(shù)后每日觀察大體情況,生存時(shí)間、統(tǒng)計(jì)生存率。在術(shù)后規(guī)定時(shí)間點(diǎn)(4、7 d)取外周血,第14天犧牲動物獲取外周血和肝臟及脾臟保存以備檢測。

1.3 凋亡脾細(xì)胞的制備

取3×106脾細(xì)胞,離心(1500 rpm/min,10m in),加入Hanks液,混勻后均勻點(diǎn)于無菌6孔板中,37℃下置于紫外線燈下照射,光源距離樣品垂直距離40 cm,波長320 nm,照射時(shí)間為20min,吸取細(xì)胞懸液,離心,去上清,加入完全培養(yǎng)基,37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培育。

1.4 肝功能測定

取各組肝移植術(shù)后外周血分離血清,通過自動生化分析儀(UVIDEC-77,Japan)測定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TB)值。

1.5 T細(xì)胞亞群分析

取未刺激的外周全血50μL并分別加入9μL PerCp-抗猴CD3mAb(購自 BeckmanCoul公司),FITC-抗猴CD4 mAb(購自BeckmanCoul公司)和APC-Cy7-抗猴CD8 mAb(購自BeckmanCoul公司),于4℃下避光孵育30 min后溶血,用PBS洗滌重懸后用FACSCanto(Beckm an-Coul,USA)檢測。采用BeckmanCoul FACSDiva軟件分析數(shù)據(jù)。

1.6 Foxp3+CD4+CD25+測定

取未刺激的外周全血50μL后加入10μL的CD4-FITC與CD25-APC cock tail(購自BeckmanCoul公司),并于4℃下避光孵育30m in以標(biāo)記CD4+CD25+T細(xì)胞;經(jīng)溶血洗滌后使用1 m L Fixation/Perm緩沖液穿膜45 m in,而后用洗滌緩沖液洗滌后加人1μL正常人血清于4℃封閉15min,之后直接加人10μL PE-抗猴Foxp3 mAb(購自 Beckm anCoul公司)或加人 10μL PE-IgG2b做為同型對照(試劑盒提供)于4℃避光孵育30 min。經(jīng)洗滌緩沖液洗滌2次后用300 μL flow cytimetry staining buffer重懸并上FACSCanto檢測。采用BeckmanCoul FACSDiva軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)算CD4+CD25+細(xì)胞中Foxp3+細(xì)胞百分率。

1.7 GITR表達(dá)分析

用RPM l 1640培養(yǎng)液按1∶1體積比稀釋采集的肝素鈉抗凝全血并充分混勻,而后加人佛波酯(167μg/L)和離子霉素(1 mg/L)在50 m L/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)6 h。刺激培養(yǎng)后的全血用于GITR檢測。Human regulatory T cell Staining kit(購自eBioscience公司),RPM l 1640培養(yǎng)基干粉(購自GIBCO公司),佛波醋和離子霉素(購自sigma公司),小牛血清(購自武漢三利生物技術(shù)公司)。取刺激培養(yǎng)后的50μL全血并分別加入 10 μL PerCp-CD3、5 μL APC-Cy7-CD8于4℃下避光孵育30 min。之后溶血并用PBS洗滌1次,用殘留的PBS重懸細(xì)胞后再加入10μLPE-抗猴G lTRmAb(購自R&D公司)或10μLPE-IgG1(購自BeckmanCoul公司)作為同型對照于4℃下避光孵育 45 m in,洗滌后用FACSCanto檢測。采用BeckmanCoul FACSDiva軟件分析數(shù)據(jù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用完全隨機(jī)方差分析。生存分析用Kaplan-Meier法作生存曲線,并用Log Rank法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),以P=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組猴肝移植術(shù)后存活期比較

Kaplan-Meier法生存曲線示A和C組存活期均大于100 d,兩組間無顯著差異。表明以貴州香豬為供體、中國獼猴為受體即使主要組織相容性抗原完全不同,肝臟移植后受體仍能獲得長期存活。B組因超急性排斥反應(yīng),受體獼猴存活期為3 h～16 d,平均生存時(shí)間(3±1.1)d,生存時(shí)間和生存率顯著降低,與陰性對照組和同種肝臟移植組及C組相比有顯著降低。

2.2 各組猴肝移植術(shù)后肝功能的變化

各組肝功能檢測,B、C兩組由于缺血再灌注及手術(shù)創(chuàng)傷引起的損害,與正常對照組相比,C組術(shù)后第4天可看到一定程度的ALT、TB升高,以后逐漸下降于術(shù)后第14天恢復(fù)正常。提示該模型術(shù)后早期出現(xiàn)了急性排斥反應(yīng)并引起了肝損害,但宿主自身可克服排斥反應(yīng)而長期生存。B組受體術(shù)后外周血血清ALT、TB值增高明顯,并持續(xù)增加,在不同時(shí)間點(diǎn)均明顯高于A、C 2組(見表1)。

表1 各組大鼠肝移植術(shù)后肝功能的變化

2.3 各組猴肝移植術(shù)后外周血T細(xì)胞亞群分析

FACSCanto檢測各組外周血T細(xì)胞亞群,3組間其CD3+T細(xì)胞計(jì)數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T細(xì)胞亞群分析顯示,3組間其CD3+CD4+T細(xì)胞無明顯變化。C組術(shù)后第4天周血CD3+CD8+略有上升,CD4+/CD8+略有下降,但在術(shù)后第7、14天恢復(fù)正常并與A組相比無明顯差異,提示該模型術(shù)后早期出現(xiàn)了急性排斥反應(yīng)并引起了肝損害,但宿主自身可克服排斥反應(yīng)而長期生存。B組CD3+CD8+/%增高明顯,并持續(xù)增加,在不同時(shí)間點(diǎn)均明顯高于A、C兩組,但是CD4+/CD8+并持續(xù)下降,在不同時(shí)間點(diǎn)均明顯低于A、C兩組。受體獼猴在接受RIC之后,再接受供者貴州香豬的BM和凋亡細(xì)胞同時(shí)靜脈輸注,可有意降低受體獼猴體內(nèi)T淋巴細(xì)胞中CD3+及CD8+細(xì)胞比率,抑制受體獼猴脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖,抑制受體獼猴脾臟CTL所占比例(見表2)。

表2 各組大鼠肝移植術(shù)后外周血T細(xì)胞亞群分析

表3 各組肝移植術(shù)后外周血中Foxp3+CD4+CD25+Treg與CD4+CD25+T細(xì)胞的比例(%)

2.4 各組猴肝移植術(shù)后外周血Foxp3+CD4+CD25+Treg和CD4+CD25+T細(xì)胞的表達(dá)

FACSCanto檢測各組外周血Foxp3+CD4+CD25+Treg,與A組相比,C組術(shù)后第4天Foxp3+CD4+CD25+Treg和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量較同種肝臟移植組有所降低但與A組相比無明顯差異,而在術(shù)后7 d、14 d時(shí)明顯上升,顯著高于A組同時(shí)間的比例。B組肝術(shù)后Foxp3+CD4+CD25+Treg和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例即呈現(xiàn)明顯下降,與顯著低于A、C組兩組同時(shí)間段的比例(見表3)。

2.5 各組猴肝移植術(shù)后外周血T細(xì)胞亞群上GITR表達(dá)分析

在獼猴的外周血中絕大多數(shù)淋巴細(xì)胞處于靜息期,未經(jīng)刺激時(shí)T細(xì)胞上不能檢出明顯GITR表達(dá),但經(jīng)佛波醋和離子霉素聯(lián)合刺激培養(yǎng)后A組以及B組和C組T細(xì)胞上GITR表達(dá)均有增加,且B組外周血T細(xì)胞亞群上的GITR表達(dá)均顯著高于A組和C組。但在不同時(shí)間點(diǎn)下T細(xì)胞亞群上GITR的表達(dá)模式不同,如C組術(shù)后第4天CD3+CD4+T細(xì)胞上的GITR表達(dá)高于其在CD3+CD8+T細(xì)胞亞群上的表達(dá),但是隨著排斥反應(yīng)增強(qiáng),GITR在CD3+CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)降低,而在CD3+CD8+T細(xì)胞上表達(dá)增加 (見表4)。

表4 各組肝移植術(shù)后外周血T細(xì)胞亞群上GITR表達(dá)分析

3 討 論

在部分品系大鼠、小鼠等動物間進(jìn)行同種異基因肝臟移植,即使主要組織相容性抗原完全不同也可以形成自發(fā)性移植免疫耐受[1]。本研究建立的異種肝移植模型,受體為猴、供體為豬,因?yàn)楹矬w內(nèi)的天然抗體及補(bǔ)體系統(tǒng)和人接近,豬器官移植給靈長類,術(shù)后立即發(fā)生介導(dǎo)超急性排斥反應(yīng)是由于受者體內(nèi)預(yù)存抗體特異性識別α-半乳糖苷(Galα1-3Gal)。

本研究結(jié)果顯示:C組受體獼猴在肝臟移植后雖能夠獲得長期存活,但術(shù)后第4、7天血清ALT、TB值與B組受體猴在肝臟移植后相比均有明顯升高,但在術(shù)后14 d左右下降到正常水平并且與正常對照組無差異,經(jīng)移植肝臟病理檢測無排斥反應(yīng)現(xiàn)象發(fā)生。表明C組實(shí)驗(yàn)組受體猴,在接受RIC之后,再接受供者貴州香豬的BM和凋亡細(xì)胞同時(shí)靜脈輸注。受體在術(shù)后早期階段可能經(jīng)歷了排斥反應(yīng)但可最終獲得自發(fā)性免疫耐受。

有研究顯示去除大鼠模型中的CD4+CD25+Treg后可以誘導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[2],提示CD4+CD25+Treg功能障礙在器官或/和細(xì)胞移植排斥反應(yīng)的病理發(fā)生中具有重要作用[3-4]。Jiang與Demirkiran等在肝移植中等也證實(shí)CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞對肝移植后形成免疫耐受抑制排斥反應(yīng)有關(guān)[5-6]。通過動態(tài)監(jiān)測三組受體猴肝移植術(shù)后外周血中CD3+CD4+T細(xì)胞的比例,3組間相比較無顯著差異。而CD3+CD8+T細(xì)胞比例監(jiān)測的結(jié)果是,B、C組和A組相比術(shù)后第4天升高明顯,并且持續(xù)至術(shù)后7 d,但C組在術(shù)后14 d恢復(fù)正常并與A組相比無明顯差異。B組受體術(shù)后CD3+CD8+T比例增高明顯,并持續(xù)增加,在不同時(shí)間點(diǎn)均明顯高于A、C組,提示B組急性排斥反應(yīng)時(shí)受體外周血中T細(xì)胞平衡失控。而且有報(bào)道CD3+CD8+T細(xì)胞高表達(dá)T細(xì)胞活化標(biāo)志HLA-DR,其分泌的細(xì)胞因子呈Th2極化[7]。此提示B組急性排斥反應(yīng)受體CD3+CD8+T細(xì)胞增殖以及功能活化明顯。大量活化的CD3+CD8+T細(xì)胞可通過其細(xì)胞毒性作用誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡增加,當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞數(shù)量超過體內(nèi)樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞的處理能力時(shí)即會增加自身抗原的暴露而促使疾病的發(fā)生發(fā)展;通過對3組受體猴肝移植術(shù)后脾臟CTL殺傷活性檢測的結(jié)果和外周血中CD3+CD8+細(xì)胞的比例動態(tài)監(jiān)測是一致。而B組受體猴體內(nèi)CD3+CD8+T細(xì)胞的過度活化,則可能是Foxp3+CD4+CD25+T reg介導(dǎo)的免疫抑制功能的障礙和GITR提供的共刺激活化信號共同作用的結(jié)果。

Piccirillo等[8]報(bào)道CD4+CD25+Treg通過抑制IL-2的分泌以及CD25的上調(diào)表達(dá)而抑制CD3+CD8+T細(xì)胞的增殖活化。對B組和C組外周血Treg的表達(dá)分析顯示急性排斥反應(yīng)組外周血Foxp3+CD4+CD25+Treg表達(dá)比例在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯低于正常對照組,而C組體內(nèi)Foxp3+CD4+CD25+T reg表達(dá)比例在術(shù)后第4天明顯低于正常對照組和同種肝臟移植組,并且持續(xù)至術(shù)后7 d,但在術(shù)后14 d恢復(fù)正常并與正常對照組和同種肝臟移植組相比無明顯差異,提示受體猴,異種肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)是因體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成障礙;而該作用的障礙使得Foxp3+CD4+CD25+Treg對CD3+CD8+T細(xì)胞的免疫抑制能力減弱,從而促使B組體內(nèi)的CD3+CD8+T細(xì)胞呈現(xiàn)出高度的功能活性,并使其在B組外周血中的表達(dá)增加,而C組術(shù)后早期外周血中的CD3+CD8+T細(xì)胞表達(dá)也是增加。B組體內(nèi)Foxp3+CD4+CD25+Treg表達(dá)的降低可能是由體內(nèi)CD3+CD4+T細(xì)胞上高表達(dá)的GITR信號介導(dǎo)的。

Roncheti等[9]報(bào)道GITR跟信號的活化可以促使CD4+CD25+Treg向效應(yīng)性+CD4+CD25+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并誘導(dǎo)其抑制活性喪失,而GITR分子在急性排斥反應(yīng)組體內(nèi)CD4+CD25+T細(xì)胞上高表達(dá)。該研究結(jié)果顯示:B組外周血中CD3+CD4+T細(xì)胞上GITR表達(dá)顯著增加,同時(shí)也顯示B組外周血中CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞膜上GITR的表達(dá)均顯著高于正常對照組,然而B組外周血中僅CD3+CD8+T細(xì)胞表達(dá)增加,提示盡管GITR信號對T細(xì)胞具有共刺激活化作用,但是 CD3+CD8+T細(xì)胞對GITR信號的活化作用似乎更為敏感。Roncheti等[9-10]報(bào)道活化的GITR-/-T細(xì)胞較 GITR+/+T細(xì)胞更易發(fā)生由CD3信號誘導(dǎo)的凋亡,GITR信號的活化有助于T細(xì)胞的存活。B組外周血中CD3+CD8+T細(xì)胞上G ITR表達(dá)的增加有可能促使其長期存活,從而使得B組外周血中CD3+CD8+T細(xì)胞表達(dá)增加。G ITR信號通過其對淋巴細(xì)胞的共刺激活化作用和凋亡抑制作用而參與了B組CD3+CD8+T細(xì)胞的增殖活化與存活,促使B組外周血T細(xì)胞亞群紊亂。

總之,本研究顯示當(dāng)受體獼猴在接受RIC之后,再接受供者貴州香豬的BM和凋亡細(xì)胞同時(shí)靜脈輸注,誘導(dǎo)異種肝移植受體自發(fā)性免疫耐受的機(jī)制,可能是通過使受體外周血中Foxp3+CD4+CD25+Treg比例增加,CD3+CD4+T細(xì)胞以及CD3+CD8+T細(xì)胞上GITR表達(dá)降低,從而使得由Foxp3+CD4+CD25+Treg介導(dǎo)的免疫抑制信號增加來實(shí)現(xiàn)。

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