同重湘，趙秀琴，馬建軍，劉志廣，曹文靜，楊永紅，呂冰，姜元，萬康林*

（1.甘肅省蘭州市肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅蘭州730046；2.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所/傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206）

228株結(jié)核分枝桿菌MLVA分型研究

同重湘1，趙秀琴2，馬建軍1，劉志廣2，曹文靜1，楊永紅1，呂冰2，姜元1，萬康林2*

（1.甘肅省蘭州市肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅蘭州730046；2.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所/傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206）

目的：通過多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（MLVA）分型，了解甘肅省臨床分離結(jié)核分枝桿菌菌株基因型情況。方法：選擇標(biāo)化的15個(gè)VNTR位點(diǎn)，對臨床分離菌株DNA進(jìn)行檢測，DNA指紋圖譜使用BioNumerics 4.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出聚類分析結(jié)果。結(jié)果：228株結(jié)核分枝桿菌被分為4大基因群，7個(gè)主要基因型，分別包含13（5.7%）、3（1.3%）、7（3.1%）、1（0.4%）、171（75.0%）、31（13.6%）、2（0.9%）個(gè)菌株；在株水平基因分型上，93（40.8%）株為獨(dú)立基因型；其余菌株基因型分別包含2～10株結(jié)核分枝桿菌，共構(gòu)成132個(gè)基因簇。結(jié)論：甘肅省臨床分離結(jié)核分枝桿菌菌株存在豐富的基因多態(tài)性，MLVA方法具有較高的基因分型能力，可以滿足結(jié)核分枝桿菌株水平DNA分型的需要。甘肅省臨床分離結(jié)核分枝桿菌菌株主要為北京家族基因型菌株。

結(jié)核分枝桿菌；多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列；基因分型；北京家族基因型

目前，基因分型技術(shù)廣泛應(yīng)用于各種病原微生物的研究。結(jié)核分枝桿菌的基因分型鑒定，對結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查、結(jié)核病監(jiān)測、傳染源發(fā)現(xiàn)、傳播途徑、發(fā)病機(jī)制、耐藥機(jī)制以及病原進(jìn)化的研究均有非常重要的意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基因分型方法在結(jié)核分枝桿菌分型中的應(yīng)用逐步得到完善。MLVA方法是眾多基因分型方法中較為成熟一種[1]，其基本原理是結(jié)核分枝桿菌基因組DNA存在獨(dú)立的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)位點(diǎn)（variable number of tandem repeats，VNTR），VNTR具有高度多態(tài)性，在結(jié)核分枝桿菌中表現(xiàn)出株水平的特異性[2]。對多個(gè)VNTR位點(diǎn)進(jìn)行檢測，可以將菌株分為不同的基因型。MLVA分型方法操作簡便，能夠提供完整的數(shù)字信息，便于利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，且穩(wěn)定性和重復(fù)性高，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)具有非常好的可比性。該方法曾用于北京、廣西、西藏及陜西等省份結(jié)核分枝桿菌基因分型的研究，取得了很好的效果。據(jù)2007年統(tǒng)計(jì)，甘肅省結(jié)核患者31 057例，死亡106例，報(bào)告發(fā)病率及死亡率分別較上年上升10.2%和22.7%，在結(jié)核病防控、診療過程中，是否可借鑒其他省份的先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)?zāi)?？首先要看我省臨床分離的結(jié)核分枝桿菌在基因分型上與其他地方是否存在同源性，這將對我省結(jié)核病防治工作者在結(jié)核病防控、診療過程中制訂防控策略提供理論依據(jù)。下面就蘭州市肺科醫(yī)院臨床分離的228株結(jié)核分枝桿菌做一研究分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

入選的228株結(jié)核分枝桿菌菌株于2005年4月～2007年6月由甘肅省蘭州市肺科醫(yī)院分離提供，其中敏感菌株100株，均由初治病例分離；耐藥菌株128株，均為耐多藥菌株，其中107例由臨床復(fù)治病例分離，21例由初治病例分離；結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.2 主要試劑

2xPCR-Mix（2倍PCR預(yù)混液）購自天根生物技術(shù)公司，100 bp DNA ladder（MBI Fermentas）購自上海生工公司，瓊脂糖（Biowest）購自基因公司，引物由上海生工合成。

1.3 VNTR位點(diǎn)選擇和操作步驟、方法

參見文獻(xiàn)[3-4]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

輸入至電子表格的菌株VNTR數(shù)據(jù)，用BioNumerics 4.5軟件進(jìn)行分析，得出聚類分析圖。

2 結(jié)果

228株臨床分離結(jié)核分枝桿菌根據(jù)VNTR重復(fù)次數(shù)，經(jīng)BioNumerics（Version3.0）軟件聚類分析后被分為4大基因群，分別包含菌株23、1、202、2株菌，其中最大的基因群為北京家族基因型，共包含202株結(jié)核分枝桿菌。主要基因類型有7個(gè)，分別包含13（5.7%）、3（1.3%）、7（3.1%）、1（0.4%）、171（75.0%）、31（13.6%）、2（0.9%）個(gè)株菌；在株水平分類上228株結(jié)核分枝桿菌被分為132個(gè)基因型，其中93株為單菌株獨(dú)立基因型，其余135株菌分屬39個(gè)基因型，各包含2～10株菌。

3 討論

本研究中筆者選取了228株2005～2007年甘肅省蘭州市肺科醫(yī)院臨床分離的結(jié)核分枝桿菌不同分類菌株作為研究對象，菌株構(gòu)成具有較強(qiáng)的代表性，基本包含了近年來本地區(qū)的流行菌株。結(jié)果表明，甘肅省主要流行株為北京家族（Beijing family）菌株，占絕大多數(shù)（202株，88.6%）。北京家族菌株在所選取的15個(gè)VNTR位點(diǎn)中，等位基因多態(tài)性由低到高排列分別為：ETR-C，ETR-B，MIRU23，ETR-D，Mtub30，MIRU27，MIRU39，Mtub39，MIRU10，ETR-A，MIRU40，ETR-E，MIRU26，MIRU16，Mtub21，其中前5個(gè)位點(diǎn)具有較高的一致性，其他位點(diǎn)可略有不同，差異主要集中在Mtub21、MIRU16、MIRU26、ETR-E等位點(diǎn)上。

在VNTR位點(diǎn)選擇上，筆者兼顧了基因群的劃分和基因型分辨能力的優(yōu)化。分辨率低的位點(diǎn)在群分類上意義明顯，分辨率高的位點(diǎn)在基因型分類上作用較大，有關(guān)VNTR位點(diǎn)分辨能力的研究可參考文獻(xiàn)[4]。北京家族菌株廣泛分布于中國及周邊國家，歐洲及美洲分布較少。以往認(rèn)為，北京家族基因型菌株的形成與耐藥突變及BCG接種相關(guān)[5-7]，但近年來也有研究表明，北京家族基因型菌株與上述因素?zé)o相關(guān)性[8]，從該基因型菌株近年來的流行趨勢分析，其易感人群廣泛、傳播速度快是其顯著特點(diǎn)之一。因此，加強(qiáng)對該基因型菌株生物學(xué)特性的研究和流行病學(xué)監(jiān)測，對今后結(jié)核病的防控具有極為重要的意義。

在株水平基因分型方面，228株結(jié)核分枝桿菌被分為132個(gè)基因型，其中93株為單菌株基因型，說明本研究選用的15個(gè)VNTR位點(diǎn)分型效果較為理想，具有較強(qiáng)的基因分型能力，有一定的應(yīng)用價(jià)值。株水平分型在追蹤結(jié)核病傳染源、結(jié)核病暴發(fā)流行調(diào)查等方面具有非常重要的意義。

綜上所述，本次研究使筆者對臨床分離結(jié)核分枝桿菌基因型情況有了較為細(xì)致的了解，同時(shí)也為筆者今后的研究方向、制訂防控措施以及臨床診療提供了一定的理論依據(jù)，達(dá)到了預(yù)期目的。

[1]Savine E,Warren RM,Vander Spuy GD,et al.Stability of variable number tandem repeats of mycobacterial interspersed repetitive units from 12 loci in seral isolates of Mycobacterium tuberculosis[J].J Clin Microbiol,2002,40:4561-4566.

[2]Skuce RA,McCorry TP,McCarrol JF,et al.Discrimination of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria using novel VNTR-PCR targets[J]. Microbiology,2002,148:519-528.

[3]呂冰,Pourcel C,劉敬華,等.結(jié)核分枝桿菌多位點(diǎn)可變數(shù)目重復(fù)序列分型方法標(biāo)準(zhǔn)化程序的建立[J].中華流行病學(xué)雜志,2008,29(9):919-924.

[4]呂冰,李兆娜,劉梅,等.45個(gè)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)用于中國結(jié)核分枝桿菌基因型鑒定的分辨力評價(jià)[J].中華流行病學(xué)雜志,2009,30 (1):63-67.

[5]Spurgiesz RS,Quitugua TN,Smith KL,et al.Molecular typing of Mycobacterium tuberculosis by using nine novel variable-number tandem repeats across the Beijing family and low-copy-number IS6110 isolates[J]. J Clin Micro,2003,41:4224-4230.

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[7]Deborah M,Gascoyne-Binzi.Rapid identification of laboratory contamination with mycobacterium tuberculosis using variable number tandem repeat analysis[J].J Clin Microbiol,2001,39:69-74.

[8]石荔,范昕建,萬康林.多位點(diǎn)可變串聯(lián)重復(fù)序列技術(shù)用于西藏地區(qū)結(jié)核分枝桿菌基因分型的初步研究[J].中華流行病學(xué)雜志,2007,28(5): 477-481.

Analysis on the 228 Mycobacterium Tuberculosis with MLVA

TONG Chongxiang1,ZHAO Xiuqin2,MA Jianjun1,LIU Zhiguang2,CAO Wenjing1,YANG Yonghong1,LU Bing2,JIANG Yuan1,WAN Kanglin2*
(1.Department of Clinical Laboratory,Lanzhou Pulmonary Hospital,Lanzhou730046,China;2.National Institute for Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control,Beijing102206,China)

Objective:By Multiple locus variable numbers of tandem repeats(MLVA)genotyping,to analyze the genotypes of epidemic Mycobacterium tuberculosis strains in Gansu.Methods:15 standardized MLVA loci were used to type the clinical isolated M.tuberculosis strains of Gansu.Results were analyzed with BioNumerics 4.5.The dendrogram was summarized from the fingerprintings.Results:The result of MLVA showed that 228 strains of M.tuberculosis were classified 4 major genetic groups and 7 main genotypes.The largest genotype included 171(75.0%)strains,the others were 13(5.7%),3(1.3%),7(3.1%),1(0.4%),31(13.6%)and 2(0.9%)respectively.Farther particulars,93 strains(40.8%)were belong to unique genotype.The other strains contained 2-10 M.tuberculosis,all 132 geno-clusters.Conclusion:The bacterium strains of M.tuberculosi in Gansu has a rich nucleotide polymorphisms.MLVA is very useful to type the genotype of M.tuberculosi strains.Beijing family genotype strain is the dominant genotype in Gansu.

Mycobacterium tuberculosis;Multiple Loci VNTR analysis;Genotyping;Beijing family genotype

R378.911

B

1673-7210（2010）06（a）-097-02

2010-01-14）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30771853）；甘肅省蘭州市重點(diǎn)科研項(xiàng)目（07-1-94）

*通訊作者