徐民俊，賀現(xiàn)輝，朱興全*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室甘肅省動(dòng)物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730046)

寄生蟲嚴(yán)重危害人和動(dòng)物的生命及健康，并造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前，對人和動(dòng)物寄生蟲病的防治仍然主要依靠使用抗寄生蟲藥物。在養(yǎng)殖業(yè)中，由于抗寄生蟲藥物的長期過度使用造成的寄生蟲抗藥性問題及動(dòng)物產(chǎn)品和環(huán)境中的藥物殘留問題，已引起人們的關(guān)注，并一直在尋找更為有效的防治寄生蟲病的新途徑。1993年在秀麗新桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中 MicroRNA(miRNA)lin-4以及l(fā)et-7的發(fā)現(xiàn)為寄生蟲的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究提供了新的契機(jī)[1-2]。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼的小RNA，在動(dòng)物中來源于長度約70 bp～90 bp的前體。前體經(jīng)過雙鏈RNA特異性的RNaseⅢ-Drosha及RNaseⅢ-Dicer和AGO作用，最終形成18 nt～22 nt長度的成熟miRNA[2-4]，然后通過與靶mRNA 3'端非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合導(dǎo)致靶基因翻譯阻遏或者降解，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后抑制調(diào)控[5-6]。

復(fù)雜的生活環(huán)境、不同的生活形態(tài)和周期以及性別分化均表明，寄生蟲具有非常復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)。開展寄生蟲miRNA研究不僅有利于了解對寄生蟲生活史，而且有助于發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶標(biāo)或設(shè)計(jì)新的核酸疫苗，為有效防治寄生蟲病提供新的途徑。本文對寄生蟲miRNA的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為寄生蟲的深入研究提供參考。

1 寄生蠕蟲

1.1 日本血吸蟲(Schistosoma japonicum) Xue等在日本血吸蟲中發(fā)現(xiàn)了5種新的miRNA，其中4種具有保守性的 miRNA(sja-let-7，sja-miR-71，sja-miR-125 和 sja-bantam)，1種(sja-miR-new1)為血吸蟲特有。對這5種新的miRNA在日本血吸蟲6個(gè)發(fā)育期中表達(dá)情況的分析表明，這些miRNA表現(xiàn)出高度的期特異性[7]。

對秀麗新桿線蟲和果蠅的研究表明，let-7具有很強(qiáng)的時(shí)序調(diào)控特性，主要在幼蟲發(fā)育后期表達(dá)，在幼蟲向成蟲的發(fā)育階段非常關(guān)鍵，而其調(diào)控機(jī)制會(huì)受到其它因素(如蛻皮激素或蛻皮激素合成過程的中間產(chǎn)物)的影響[8]。在日本血吸蟲研究中發(fā)現(xiàn)的let-7均表現(xiàn)為高度的期特異性；其表達(dá)量在毛蚴期非常低，而胞蚴期為毛蚴期的12倍，在尾蚴期達(dá)到高峰。因此，推測let-7在中間宿主釘螺中與毛蚴至尾蚴的發(fā)育調(diào)控相關(guān)[7]，但尚未得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

另外兩種miRNA sja-miR-71和sja-bantam的表達(dá)情況與let-7類似，都是在毛蚴期開始表達(dá)，在尾蚴期達(dá)到高峰。而尾蚴是血吸蟲的感染期，當(dāng)尾蚴進(jìn)入宿主動(dòng)物細(xì)胞后，sja-miR-71的表達(dá)立刻降到最低水平然后進(jìn)入童蟲期，并在此后的生命活動(dòng)過程中始終保持在較低的水平。sja-miR-71在尾蚴期的表達(dá)量高于童蟲期近1 000倍，sja-bantam則高達(dá)近500倍。這種表達(dá)量的變化只與生活周期變化相關(guān)，與性別無關(guān)[7]。由于寄生蟲在感染宿主之前必然有基因表達(dá)模式的改變和相關(guān)的蛋白表達(dá)，miR-71和bantam的變化規(guī)律似乎表明這兩種miRNA與尾蚴入侵宿主細(xì)胞相關(guān)的基因調(diào)節(jié)活動(dòng)密切相關(guān)。

值得注意的是，miR-71和bantam及其前體都是高度保守的。根據(jù)Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫(Version11.0，http://www.mirbase.org/)登錄的數(shù)據(jù)，miR-71不唯寄生蟲獨(dú)有，也存在于其它物種中(包括人類、小鼠、蜜蜂、蠶、渦蟲等)。不過，目前尚未見到miR-71在植物和病毒中的報(bào)道，是否miR-71只存在動(dòng)物中還有待研究。此外，miR-71在不同物種中通常都具有很大的家族，包括miR-71a、miR-71a-1、miR-71b和 miR-71c等。Bantam存在于果蠅、蠶和渦蟲等節(jié)肢動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中，在哺乳類動(dòng)物及植物中未見報(bào)導(dǎo)。除此之外，在果蠅中的研究也已表明，bantam通過對hid基因的調(diào)控影響細(xì)胞的增殖和凋亡，bantam的沉默導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力降低或者凋亡速度增加，減少內(nèi)源性bantam編碼基因?qū)е耯id基因表達(dá)量上升，而增加內(nèi)源性bantam編碼基因則反之[11]。這些現(xiàn)象表明，miR-71和bantam在寄生蟲侵染宿主相關(guān)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程中似乎并不是關(guān)鍵因素，其表達(dá)量的提高很可能與寄生蟲細(xì)胞的基礎(chǔ)生理代謝有關(guān)，即當(dāng)寄生蟲感染宿主時(shí)，相關(guān)基因大量表達(dá)，所需要的基礎(chǔ)代謝隨之提高，相應(yīng)地激發(fā)了miR-71的表達(dá)，以對基礎(chǔ)代謝進(jìn)行精確調(diào)控。這表明miR-71和bantam與生長發(fā)育密切相關(guān)，但是否作為寄生蟲侵染宿主的調(diào)控因子仍然有待進(jìn)一步研究。

此外，基礎(chǔ)代謝率的提高是否能引起寄生蟲的miR-71或bantam表達(dá)量的相應(yīng)提高，或者通過RNA沉默技術(shù)下調(diào)miR-71或bantam的表達(dá)從而導(dǎo)致其基礎(chǔ)代謝的紊亂，抑制幼蟲發(fā)育甚至阻礙尾蚴對宿主侵染，有關(guān)這方面的研究目前尚未見報(bào)道。如果假設(shè)成立，通過RNA沉默技術(shù)阻礙相關(guān)miRNA，尤其let-7、miR-71或bantam的表達(dá)將為控制寄生蟲發(fā)育和感染提供一條新途徑。

1.2 曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni) Gomes等通過生物信息學(xué)分析方法發(fā)現(xiàn)了曼氏血吸蟲SmDicer1和SmAgo2/3/4蛋白編碼基因并在尾蚴、成蟲、卵和體外培養(yǎng)的曼氏血吸蟲中對其表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明SmDicer1和SmAgo2/3/4在不同發(fā)育階段表達(dá)水平不同，推測miRNA的調(diào)控可能是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的，并借此對曼氏血吸蟲生活史的不同發(fā)育階段進(jìn)行調(diào)控[9]。曼氏血吸蟲的Dicer基因(SmDicer)長度超過了54 kb，包含30個(gè)外顯子，可以編碼一個(gè)2 641氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，是目前已知最大的Dicer蛋白[10]。Dicer和AGO蛋白的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明在血吸蟲中存在miRNA調(diào)控體系。

此外，在血吸蟲中發(fā)現(xiàn)的miRNA還包括：Copeland等通過生物信息學(xué)手段從曼氏血吸蟲中發(fā)現(xiàn)的1種miRNA(miR-124)，該miRNA也存在于日本血吸蟲中。同時(shí)發(fā)現(xiàn)的另外一種miRNA(miR-287)，似乎只存在于曼氏血吸蟲中。在與血吸蟲遺傳距離較遠(yuǎn)的渦蟲(Schmidtea mediterranea)中發(fā)現(xiàn)的71種miRNA中，miR-124及miR-749在血吸蟲的兩個(gè)種中均保守存在[12]。

2 寄生原蟲

2.1 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia) AGO蛋白在藍(lán)氏賈第鞭毛蟲發(fā)育過程中起重要作用，它可以特異性地與m(7)G-帽子結(jié)合，從而協(xié)助miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控?，F(xiàn)在已經(jīng)明確，藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的至少4種miRNA來源于細(xì)胞內(nèi)的小核仁RNA(Small nucleolar RNA，snoRNA)。在Dicer的作用下，snoRNA GlsR17被加工為26 nt大小的miRNA(miR2)。熒光素酶(Luciferase)基因在其 3'端包含6個(gè)與miR2作用位點(diǎn)一致的序列，將該酶的mRNA與人工合成的miR2共同溫育，則導(dǎo)致熒光素酶的表達(dá)量下降40%，而mRNA的穩(wěn)定性并不受影響。因此，miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控很可能是通過翻譯阻遏而不是mRNA降解完成的。通過核糖體反義RNA抑制藍(lán)氏賈第鞭毛蟲AGO蛋白的表達(dá)，熒光素酶的合成則不會(huì)受到影響。另一方面，Dicer基因的沉默則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中snoRNA不能被分解，相應(yīng)miRNA在細(xì)胞中的含量急劇降低。同時(shí)變異表面糖蛋白(Variant surface glycoprotein，VSG)表達(dá)不受限制，由單一表達(dá)變成多表達(dá)，表明調(diào)節(jié)藍(lán)氏賈第蟲的抗原變異是miRNA的沉默調(diào)節(jié)功能之一[13-14]。

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲是miRNA研究中第一個(gè)經(jīng)過克隆和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的原蟲。起源于snoRNA的具有miRNA功能的小RNA的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了寄生原蟲的調(diào)節(jié)性小RNA的來源。該研究首次提出miRNA來源于snoRNA，而不是由miRNA基因本身編碼，意味著在miRNA介導(dǎo)的基因沉默過程中很可能有我們尚未發(fā)現(xiàn)的新途徑[15]。這種現(xiàn)象也意味著在寄生蟲和宿主中起源于其它含量豐富的RNA分子(如 rRNA，tRNA和 snRNA)并且與 AGO相關(guān)的小 RNA很可能也具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能。

2.2 布氏錐蟲(Typanosoma brucei) Mallick等預(yù)測了1 889個(gè)成熟的miRNAs，以及這些miRNA潛在的VSG作用位點(diǎn)[16]。在布氏錐蟲的基因組中也發(fā)現(xiàn)了類似Dicer編碼基因功能的序列，Dicer編碼基因和預(yù)測的miRNA意味著在錐蟲中存在著miRNA調(diào)節(jié)的功能性網(wǎng)絡(luò)。此外，在布氏錐蟲中發(fā)現(xiàn)了一些siRNA(Small interfering RNA)，具有類似miRNA功能，可以導(dǎo)致相關(guān)mRNA的降解。與miRNA不同，這些siRNA長度約25 nt，來自于長的dsRNA，并且具有轉(zhuǎn)座子(transposon)特性[17-18]。

2.3 陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis) Lin等從陰道毛滴蟲中發(fā)現(xiàn)了9種miRNA。這9種miRNA在其它22種原蟲基因組中至少存在一個(gè)同源miRNA拷貝，其中miR-006高度保守。但是在溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)、利什曼原蟲(Leishmaniaspp.)和錐蟲中未發(fā)現(xiàn)任何同源性。除此之外，在陰道毛滴蟲中至少存在兩種AGO蛋白(tvAGO1和tvAGO2)，AGO蛋白的發(fā)現(xiàn)證明了miRNA在陰道毛滴蟲中的調(diào)控是確實(shí)存在的[19]。由此可見，寄生蟲基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及miRNA的種類在某些物種間具有較大的差異。

2.4 瘧原蟲(Plasmodium) 雖然在瘧原蟲中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄后抑制現(xiàn)象，并且找到了mRNA保守的3'端非翻譯區(qū)，但是卻沒有發(fā)現(xiàn)與miRNA調(diào)節(jié)作用相關(guān)的Dicer和AGO相關(guān)蛋白基因[20-22]。此外，不同研究者從被瘧原蟲感染的紅細(xì)胞中均只發(fā)現(xiàn)了大量的人類miRNA(以miR-451為主)，而在純化的瘧原蟲中沒有發(fā)現(xiàn)任何miRNA或者siRNA，而且miR-45似乎只與紅細(xì)胞成熟分化以及形態(tài)維持相關(guān)，與瘧原蟲感染與否無關(guān)[23-24]。這似乎意味著瘧原蟲具有不同的調(diào)控機(jī)制。

2.5 溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica) De等從溶組織內(nèi)阿米巴中預(yù)測了17個(gè)miRNA，并且從該寄生蟲的基因組中發(fā)現(xiàn)了與miRNA調(diào)控相關(guān)的AGO及Dicer蛋白的相關(guān)編碼基因[25]。這些miRNA的功能可能包括參與GTP-結(jié)合蛋白(miR-2a)、蛋白激酶(miR-3a)和Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子(miR-15b)的作用等。

3 節(jié)肢動(dòng)物

3.1 按蚊(Anophelesspp.) Mead等在17日齡的雌性斯氏按蚊(A.stephensi)中分離到27種miRNA，7種與岡比亞按蚊(A.gambiae)的miRNA具有同源性，4種為新發(fā)現(xiàn)的miRNA(miR-x1-miR-x4)，這些miRNA對斯氏按蚊從晚期胚胎到成蟲的發(fā)育非常關(guān)鍵[26]。在4種新發(fā)現(xiàn)的miRNA中，miR-x2在斯氏按蚊和埃及伊蚊(Aedes aegypti)中保守，并且主要分布在卵巢中，在按蚊飽食血液72 h之后，表達(dá)量急劇下降，因此推測其功能在不同種類的蚊科中均與生殖調(diào)控相關(guān)。miR-14在按蚊胚胎晚期到成蟲的發(fā)育過程中表達(dá)量非常高(占測序miRNA數(shù)目的25%)，并且此后在按蚊成蟲一生之中持續(xù)表達(dá)，這種表達(dá)與性別、年齡和進(jìn)食過血液與否無關(guān)。由于其在果蠅中與細(xì)胞壽命和凋亡密切相關(guān)，因此推測其對按蚊生活史各個(gè)階段的生長發(fā)育調(diào)控至關(guān)重要。

Winter等從感染瘧原蟲后的岡比亞按蚊中分離到18種miRNA[27]。其中12種在蟲體的各個(gè)部位分布均勻，并且與性別無關(guān)，而其它6種則與消化系統(tǒng)緊密關(guān)聯(lián)。瘧原蟲存在與否會(huì)直接影響到其中4種miRNA的表達(dá)模式，當(dāng)瘧原蟲感染時(shí)，在瘧蚊中腸中Aga-miR-34，A-ga-miR-1174和Aga-miR-1175表達(dá)量均下降超過 50%，Aga-miR-989則升高了近4倍。同時(shí)，在其它組織和器官中Aga-miR-989表達(dá)量則下降了60%。通過dsRNA對Dicer1和AGO1基因進(jìn)行的沉默研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Dicer1和AGO1不存在時(shí)瘧原蟲對瘧蚊的感染敏感性增加。由此推斷，miRNA在瘧蚊的抗瘧原蟲感染方面發(fā)揮著重要作用。

3.2 肩突硬蜱(Ixodes scapularis) Wheeler等在研究物種進(jìn)化的過程中，獲得肩突硬蜱的32種miRNA，并被Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫收錄[28]。這 32種 miRNA與 miRBase數(shù)據(jù)庫收錄的其它寄生蟲，包括日本血吸蟲(5種)，曼氏血吸蟲(5種)以及按蚊(66種)miRNA序列相比，只有bantam，let-7，miR-71，和miR-125等4種miRNA是保守的。同為節(jié)肢動(dòng)物，肩突硬蜱與瘧蚊之間有24種保守miRNA。

4 小結(jié)與展望

目前發(fā)現(xiàn)的寄生蟲miRNA主要為表達(dá)豐度高和分布廣的種類，例如let-7，miR-71和bantam等；而表達(dá)豐度低、呈期特異性的miRNA發(fā)現(xiàn)的很少；已發(fā)現(xiàn)的miRNA主要與生長發(fā)育相關(guān)，與寄生蟲侵染宿主相關(guān)的關(guān)鍵miRNA尚未見報(bào)導(dǎo)。此外，盡管目前在寄生蟲中預(yù)測的miRNA已經(jīng)接近2 000種，但是多數(shù)miRNA的具體功能仍然有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

據(jù)估計(jì)，細(xì)胞中miRNA總數(shù)占基因組所有編碼基因的1%～3%，因此其在生長發(fā)育和形態(tài)調(diào)控中必定有著巨大作用等待深入研究。絕大多數(shù)miRNA的表達(dá)具有發(fā)育階段的特異性、時(shí)序性或組織特異性，這也從側(cè)面說明了其在基因調(diào)控方面的作用[2,29-30]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的寄生蟲miRNA表明，miRNA廣泛地參與了寄生蟲發(fā)育過程的生理代謝過程，但是其具體的作用機(jī)理仍然有待深入研究。

[1]Lee R C,Feinbaum R L,Ambros V.TheC.elegansheterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[2]Reinhart B J,Slack F J,Basson M,et al.The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing inCaenorhabditis elegans[J].Nature,2000,403(6772):901-906.

[3]Hutvágner G,McLachlan J,Pasquinelli A E,et al.A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of thelet-7 small temporal RNA[J].Science,2001,293(5531):834-838.

[4]Ruby J G,Jan C H,Bartel D P.Intronic microRNA precursors that bypass Drosha processing[J].Nature,2007,448(7149):83-86.

[5]Bartel D P.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[6]Thermann R,Hentze M W.DrosophilamiR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation [J].Nature,2007,447(7146):875-878.

[7]Xue X,Sun J,Zhang Q,et al.Identification and characterization of novel microRNAs fromSchistosoma japonicum[J].PLoS One,2008,3(12):e4034.

[8]Sempere L F,Dubrovsky E B,Dubrovskaya V A,et al.The expression of thelet-7 small regulatory RNA is controlled by ecdysone during metamorphosis inDrosophila melanogaster[J].Dev Biol,2002,244(1):170-179.

[9]Gomes M S,Cabral F J,Jannotti-Passos L K,et al.Preliminary analysis of miRNA pathway inSchistosoma mansoni[J].Parasitol Int,2009,58(1):61-68.

[10]Krautz-Peterson G,Skelly P J.Schistosoma mansoni:the dicer gene and its expression[J].Exp Parasitol,2008,118(1):122-128.

[11]Brennecke J,Hipfner D R,Stark A,et al.Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid inDrosophila[J].Cell,2003,113(1):25-36.

[12]Copeland C C,Marz M,Rose D,et al.Homology-based annotation of non-coding RNAs in the genomes ofSchistosoma mansoniandSchistosoma japonicum[J].BMC Genomics,2009,10:464.

[13]Saraiya A A,Wang C C.SnoRNA,a novel precursor of microRNA inGiardia lamblia[J].PLoS Pathog,2008,4(11):e1000224.

[14]Prucca C G,Slavin I,Quiroga R,et al.Antigenic variation inGiardia lambliais regulated by RNA interference[J].Nature,2008,456(7223):750-754.

[15]Kolev N G,Ullu E.SnoRNAs inGiardia lamblia:a novel role in RNA silencing?[J].Trends Parasitol,2009,25(8):348-350.

[16]Mallick B,Ghosh Z,Chakrabarti J.MicroRNA switches inTrypanosoma brucei[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,372(3):459-463.

[17]Djikeng A,Shi H,Tschudi C,et al.RNA interference inTrypanosoma brucei:cloning of small interfering RNAs provides evidence for retroposon-derived 24-26-nucleotide RNAs[J].RNˇA,2001,7(11):1522-1530.

[18]Ngo H,Tschudi C,Gull K,et al.Double-stranded RNA induces mRNA degradation inTrypanosoma brucei[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(25):14687-14692.

[19]Lin W C,Li S C,Lin W C,et al.Identification of microRNA in the protistTrichomonas vaginalis[J].Genomics,2009,93(5):487-493.

[20]Aravind L,Iyer L M,Wellems T E,et al.Plasmodiumbiology:genomic gleanings[J].Cell,2003,115(7):771-785.

[21]Ullu E,Tschudi C,Chakraborty T.RNA interference in protozoan parasites[J].Cell Microbiol,2004,6(6):509-519.

[22]Hall N,Karras M,Raine J D,et al.A comprehensive survey of thePlasmodiumlife cycle by genomic,transcriptomic,and proteomic analyses[J].Science,2005,307(5706):82-86.

[23]Rathjen T,Nicol C,McConkey G,et al.Analysis of short RNAs in the malaria parasite and its red blood cell host[J].FEBS Lett,2006,580(22):5185-5188.

[24]Xue X,Zhang Q,Huang Y,et al.No miRNA were found inPlasmodiumand the ones identified in erythrocytes could not be correlated with infection[J].Malar J,2008,7:47-50.

[25]De S,Pal D,Ghosh S K.Entamoeba histolytica:computational identification of putative microRNA candidates[J].Exp Parasitol,2006,113(4):239-243.

[26]Mead E A,Tu Z.Cloning,characterization,and expression of microRNAsfrom the Asian malariamosquito,Anopheles stephensi[J].BMC Genomics,2008,9:244.

[27]Winter F,Edaye S,Hüttenhofer A,et al.Anopheles gambiaemiRNAs as actors of defence reaction againstPlasmodiuminvasion[J].Nucleic Acids Res,2007,35(20):6953-6962.

[28]Wheeler B M,Heimberg A M,Moy V N,et al.The deep evolution of metazoan microRNAs[J].Evol Dev,2009,11(1):50-68.

[29]Lim L P,Glasner M E,Yekta S,et al.Vertebrate microRNA genes[J].Science,2003,299(5612):1540.

[30]Ambros V.MicroRNA pathways in flies and worms:growth,death,fat,stress and timing[J].Cell,2003,113(6):673-676.