劉珊珊，韓文瑜，雷連成，孫長江，張俊敏，刁昱文，杜濤峰

(吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長春130062)

結(jié)核病嚴重威脅著人類健康，據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium)感染者約占全球總?cè)丝诘娜种?，每年約有800萬新發(fā)病例，200多萬死亡病例，死亡人數(shù)居單一傳染病之首[1]。結(jié)核分枝桿菌與人類長期持續(xù)的斗爭中，不斷進化，自我完善，能夠有效抵抗宿主的免疫防御以及各種抗菌藥物的作用。而在眾多的抗菌藥中，可以用于治療結(jié)核病的僅有幾種，而且都已經(jīng)問世近半個世紀。由于藥物選擇的局限、治療過程長、治療費用昂貴、藥物副作用的嚴重以及患者的不配合等，都給病原菌抗藥基因變異提供了機會，致使全球范圍內(nèi)耐藥結(jié)核分枝桿菌增多[2]。這就要求新一代的抗結(jié)核分枝桿菌藥物，必須具備能縮短療程，對感染期以及潛伏期的結(jié)核分枝桿菌具有殺傷力的特性。因此，深入了解宿主、結(jié)核分枝桿菌、抗菌藥物的相互作用機制，才能夠進行有效的治療。

1 結(jié)核分枝桿菌抗巨噬細胞吞噬策略

結(jié)核分枝桿菌被巨噬細胞捕獲后，存留在空泡狀結(jié)核分枝桿菌吞噬小體中[3]，在吞噬體中的結(jié)核分枝桿菌能利用其膜阻礙系統(tǒng)使吞噬體不能與溶酶體融合。從而在無殺傷力的吞噬體中，結(jié)核分枝桿菌減少自身的代謝，并抵抗來自宿主諸如氧化劑或抗菌肽等的毒殺作用，使其在原本具有吞噬和清除入侵者的巨噬細胞中安全存活下來。從而從急性感染期演變?yōu)槁愿腥酒?，并且等待合適的機會再次致病。

結(jié)核分枝桿菌被巨噬細胞吞噬是通過宿主表面受體介導(dǎo)的，包括甘露糖受體、補體受體和Fc受體等[4]。其中補體受體3(CR3)介導(dǎo)的攝入過程是體外試驗中最重要的吞噬途徑之一[5]，而該過程需要在吞噬細胞受脂器中有膽固醇的積聚，使用洛伐他定和β-環(huán)糊精等膽固醇螯合劑，導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌不能被巨噬細胞吞噬[6]。而膽固醇在該過程中具體的作用尚不明確，可能是通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和CR3受體共同作用，也可能是通過提高疏水性細胞膜區(qū)域的微黏度來允許有效的肌動蛋白形成，從而促進吞噬細胞的吞噬[7]。而膽固醇介導(dǎo)的吞噬作用同時還需要宿主管蛋白1的存在，有研究表明管蛋白1需要Ca2+依賴的磷酸酶鈣神經(jīng)素來抑制吞噬體的生物合成[8]。最近研究報道，通過環(huán)孢菌素A或FK506來抑制鈣神經(jīng)素，提高溶酶體的傳遞并減少了分子內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的存活率[9]。當結(jié)核分枝桿菌感染管蛋白1缺失小鼠時，鈣神經(jīng)素不能被激活，溶酶體快速傳遞并可殺死胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌。

鈣神經(jīng)素通過去磷酸化激活T細胞反應(yīng)，反過來激活I(lǐng)L-2和其它細胞因子的轉(zhuǎn)錄，而這些細胞因子是T細胞存活所必須的。而且，研究顯示管蛋白1只存在活的結(jié)核分枝桿菌吞噬體膜表面[10]，表明這是一個激活過程，利用宿主蛋白使自己在吞噬細胞中存活，展示了一個病原微生物進化的完美例子。

宿主和結(jié)核分枝桿菌在激活的吞噬細胞中相互作用，致病結(jié)核分枝桿菌通過阻礙溶酶體和吞噬體的融合，阻礙了巨噬細胞的吞噬殺傷作用。當IFN-γ作用時[11]，巨噬細胞的吞噬作用被激活。IFN-γ是免疫防御系統(tǒng)抵抗感染的重要成分，事實上很多免疫機制如白細胞內(nèi)皮細胞的相互作用、抗原提呈、細胞的生長和凋亡以及吞噬體和溶酶體的融合都是由IFN-γ調(diào)控的[12]。IFN-γ基因缺陷的鼠和人類都具有結(jié)核易感性。最近報道了一個關(guān)于IFN-γ抑制胞內(nèi)病原菌生長所必須的效應(yīng)器Lrg-47，是IFN-γ介導(dǎo)的P47 GTP酶家族中的一種鳥苷三磷酸酶蛋白，是各種胞內(nèi)病原菌免疫調(diào)節(jié)器[13]。因此，在Lrg-47減少的的巨噬細胞中，IFN-γ不能促進吞噬體和溶酶體的融合，從而不能清除胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌，更加證明溶酶體成熟對于宿主控制結(jié)核分枝桿菌增殖的作用[14]。

許多宿主激酶涉及到吞噬體成熟過程[15]，而結(jié)核分枝桿菌蛋白激酶也參與宿主信號途徑，該系統(tǒng)由11個不同的真核樣蛋白激酶組成。其中蛋白激酶G最近被發(fā)現(xiàn)具有阻礙吞噬體成熟和促進胞內(nèi)菌存活的作用[16]。亞細胞定位研究顯示蛋白激酶G存在于感染結(jié)核分枝桿菌的吞噬體管腔和巨噬細胞的胞質(zhì)內(nèi)，而在感染了死菌的巨噬細胞中則不存在。證明該蛋白激酶是結(jié)核分枝桿菌的一個毒力因子，由致病的結(jié)核分枝桿菌分泌到宿主胞質(zhì)中，干擾了溶酶體和吞噬體的融合。這將是殺死巨噬細胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌很好的藥物靶位，其優(yōu)勢之一是不直接殺死病原菌，而是通過激活巨噬細胞其固有的殺菌活性，將胞內(nèi)存活的結(jié)核分枝桿菌傳遞給溶酶體。優(yōu)勢之二是其抑制作用不需要穿過難以滲入的細胞壁，大大提高了其殺菌能力。

在體外試驗中，感染后期的巨噬細胞逐漸被激活，結(jié)核分枝桿菌便逐步從定居的吞噬體中轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)，導(dǎo)致巨噬細胞凋亡進程加快。一旦進入胞質(zhì)，結(jié)核分枝桿菌就能募集宿主支架因子，導(dǎo)致肌動蛋白聚集，形成細胞間的傳播[17]。該功能是依賴于結(jié)核分枝桿菌分泌的獨立因子ESAT-6和CFP-10，一旦阻礙吞噬體與溶酶體融合失敗后，結(jié)核分枝桿菌就會利用該功能，使得臨近細胞受到感染。

2 結(jié)核分枝桿菌細胞壁的低滲入性

結(jié)核分枝桿菌通過系列的分子機制來中和眾多抗菌藥的活性，由于其獨特的細胞壁結(jié)構(gòu)，靶向結(jié)核分枝桿菌胞漿或是分子內(nèi)肽聚糖層的藥物在到達靶位之前就已經(jīng)失去了大部分活性。該結(jié)構(gòu)包括親水的阿拉伯半乳聚糖覆蓋在肽聚糖層表面，以阻止疏水化合物進入，而阿拉伯半乳聚糖是由一長串疏水的分枝菌酸包裹著，限制親水性物質(zhì)的滲透，這3層相互共價連接，作為阻止抗菌藥物滲入的堅實屏障。另外，在這3層的外部存在一個由海藻糖去霉菌酸酯和糖肽脂構(gòu)成的流動層。對結(jié)核分枝桿菌霉菌酸酯合成基因突變分析顯示，在抗藥性和霉菌酸酯含量之間存在著聯(lián)系，恥垢結(jié)核分枝桿菌霉菌酸酯合成基因突變時便顯示出藥物攝入率提高和對紅霉素、氯霉素、新生霉素和利福平等的敏感性增強[18]。

結(jié)核分枝桿菌對抗菌藥的耐受性來源于協(xié)同作用機制的全效保護，而細胞壁只是這個高端效應(yīng)的一小分支而已。事實上，無論細胞表面阻礙作用多么強大都會在細胞周期的某一時間段允許致死量的親水性抗菌藥物進入，如果沒有其他的保護機制，這些在胞漿內(nèi)積聚的抗菌藥足夠殺死細菌。由于細胞壁屏障明顯的延緩了藥物的進入，而分子內(nèi)的抵抗系統(tǒng)才能更加有效的抵抗已進入的抗生素。

3 結(jié)核分枝桿菌的藥物鈍化和靶位修飾策略

β內(nèi)酰胺抗生素通過抑制細胞壁和肽聚糖合成來殺死細菌，結(jié)核分枝桿菌對該類藥物的抵抗一方面通過細胞壁的穿透障礙限制其滲入，同時還擁有有效的β內(nèi)酰胺水解酶，體外試驗和臨床均證實β內(nèi)酰胺抗生素和內(nèi)酰胺水解酶抑制劑共同使用能有效殺死結(jié)核分枝桿菌[19]?；蚍治鲲@示在結(jié)核分枝桿菌中編碼內(nèi)酰胺水解酶的基因為blaC和blaS，因此內(nèi)酰胺水解酶抑制劑和破壞細胞壁藥物的聯(lián)合應(yīng)用將是一種有效的治療方案。

大環(huán)內(nèi)酯類藥物抑制細菌蛋白質(zhì)生物合成，通過可逆綁定在細菌核糖體50S亞基核糖體RNA特定區(qū)域，來抑制tRNA對氨基酸的翻譯。但這類抗生素對于包括牛結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌通常沒有效果。有趣的是，卡介苗(BCG)卻對大環(huán)內(nèi)酯類顯示出高度敏感性，后來發(fā)現(xiàn)是因為缺失編碼核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶的Erm37基因[20]。該基因可以將23S核糖體甲基化，來改變核糖體的結(jié)構(gòu)從而降低了抗生素對于該核糖體的親和力。而通過體外試驗分析表明Erm37通過約束大環(huán)內(nèi)酯類來保護核糖體，以此減少該類藥物對于蛋白質(zhì)生物合成的抑制。

喹諾酮類藥物通過與DNA促旋酶相互作用來抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。對結(jié)核分枝桿菌MfpA基因的研究揭示了結(jié)核分枝桿菌針對喹諾酮類藥物神奇的防御策略，該蛋白擁有一個和DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)類似的三維空間結(jié)構(gòu)。該空間結(jié)構(gòu)可以模仿DNA阻斷喹諾酮類藥物對于結(jié)核分枝桿菌DNA的破壞。盡管MfpA確切功能還不明確，但這個發(fā)現(xiàn)為我們展示了細菌面對生存壓力，人類防御等不利條件時進化出了完美的適應(yīng)性調(diào)整策略[21]。

最近報道了一個新的分枝桿菌耐藥決定機制，該機制與其獨特的抗氧化壓力系統(tǒng)相關(guān)。大多數(shù)細菌通過谷胱甘肽減少巰基化來抵抗氧化壓力，而放線菌不能利用谷胱甘肽。事實上它們產(chǎn)生了一個巰基包含物(Mycothiol)，可能直接參與對多種抗菌藥物如萬古霉素、利福平和β內(nèi)酰胺酶抗生素等抵抗作用[22]。抑制Mycothiol的活性，可以導(dǎo)致分枝桿菌對藥物的敏感性顯著提高，而宿主巨噬細胞對分枝桿菌的殺傷性也相應(yīng)增強[23]。

4 對于多重藥耐藥的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

微生物能監(jiān)控多重有害因素，并做出反應(yīng)，對于它們生存在復(fù)雜的宿主環(huán)境中是至關(guān)重要的。越來越多的證據(jù)顯示結(jié)核分枝桿菌利用復(fù)雜機制來識別并保護自身免于被抗生素和機體免疫系統(tǒng)攻擊。這些復(fù)雜體系通常是由一些結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，來識別眾多的抗菌藥物中的不同靶位。事實上，在以往的研究中發(fā)現(xiàn)細菌經(jīng)常利用染色體包裝策略來對諸如抗生素治療等多重壓力做出反應(yīng)[24]。因此，有理由推斷結(jié)核分枝桿菌中存在一個主要的調(diào)控系統(tǒng)，直接或間接識別多種抗菌藥物和宿主防御，并調(diào)整各個蛋白的表達及其活性。近來報道了一個這樣的系統(tǒng)[25]，組蛋白類似蛋白Lsr2，是一個分子量為12 ku的基本蛋白，僅存在于包括結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的放線桿菌中。試驗顯示Lsr2的功能是作為DNA連接蛋白來連接遠處的DNA片段，提示該蛋白在組織和包裝結(jié)核分枝桿菌染色體上起了重要作用。同時發(fā)現(xiàn)它具有抑制乙胺丁醇導(dǎo)致的iniABC操縱子轉(zhuǎn)錄的功能，該基因編碼了結(jié)核分枝桿菌多種藥物流出泵。比較基因組學(xué)分析顯示Lsr2可能編碼包括細胞壁生物合成和基礎(chǔ)代謝在內(nèi)的數(shù)百個基因的轉(zhuǎn)錄[26]。而Lsr2基因的缺失會導(dǎo)致iniABC操縱子的轉(zhuǎn)錄增加，結(jié)果導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對多重藥物的耐受增加。

耐藥性可能反映了宿主內(nèi)發(fā)生的生理性調(diào)整，也可能包含了一個存在于持續(xù)感染過程中未界定的階段。而wbiB早期孢子基因就是一個例子，在鏈霉素中該基因主要是裝備啟動細胞分裂和孢子形成所必須的隔片。wbiB樣基因存在于結(jié)核分枝桿菌中，提示著也存在著類似的功能和程序機制。事實上wbiB基因在恥垢結(jié)核分枝桿菌中對于隔的形成和細胞分裂是必需的。其中一個wbiB樣基因wbiB7最初是在變鉛青鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)，作為一個多重耐藥決定因子，wbiB7突變變鉛青鏈霉菌能夠正常生長，卻表現(xiàn)出對臨床上相關(guān)甚至不相關(guān)的抗菌藥(氯霉素，大環(huán)內(nèi)酯類，潔霉素，利福平，四環(huán)素等)的高度敏感性。在包括結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的許多結(jié)核分枝桿菌屬中敲除wbiB7基因均導(dǎo)致多重藥物敏感表型，證明該基因是一個原始的耐藥性決定基因。然而像whiB7這樣一個如此小的蛋白如何抵抗作用機制不同，靶向不同的多種藥物呢？用cDNA微陣列分析基因表達，顯示whiB7至少控制著8個基因調(diào)節(jié)子的表達，而其中至少有4個基因的功能和其內(nèi)在抗藥性有關(guān)[27]。有趣的是，whiB7基因和其調(diào)節(jié)子的表達是由與之接觸的亞抑菌濃度的藥物誘導(dǎo)的，而且呈時間和劑量相關(guān)性。大量試驗顯示wbiB7的表達也被脂肪酸誘導(dǎo)，表明whiB7對結(jié)核分枝桿菌在巨噬細胞中的存活是必須的。wbiB7對于結(jié)核分枝桿菌存活和與宿主相互作用的功能最新的研究顯示，通過控制eis基因的轉(zhuǎn)錄，來調(diào)整結(jié)核分枝桿菌在巨噬細胞內(nèi)的存活[28]，同時影響宿主細胞因子的分泌和T細胞的功能[29]?？股刂委煂?dǎo)致的結(jié)核分枝桿菌對藥物治療和機體免疫抵抗力均獲得增加，對應(yīng)用抗生素來治療細菌感染提出了警告。然而，靶向這種雙相系統(tǒng)的藥物可以同時殺死病原菌并最大限度的減少耐藥性的出現(xiàn)。

5 TOLL樣受體和維生素D依賴的抗菌肽反應(yīng)

Toll樣受體參與細胞的先天性免疫，并通過激活信號的級聯(lián)反應(yīng)來調(diào)節(jié)獲得性免疫，從而抵抗侵入的微生物。最新的研究表明，Toll樣受體能夠介導(dǎo)宿主細胞清除胞內(nèi)分枝桿菌。其機理為Toll樣受體被激活的同時會誘導(dǎo)維生素D受體和維生素D-1水解酶基因表達上調(diào)，促進抗微生物肽的產(chǎn)生，從而更有效的殺死胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌[30]。這項研究同時還揭示了維生素D在抵抗肺結(jié)核中的作用，并進一步解釋了不同種族人群對結(jié)核分枝桿菌易感性的不同。非洲人皮膚上黑色素含量高，紫外線(UV)依賴維生素D3合成能力較低，抗菌肽的量也相應(yīng)減少，因此當感染了結(jié)核分枝桿菌時，免疫系統(tǒng)固有的殺菌能力不足以抵抗病原菌，表現(xiàn)出了結(jié)核易感性。

6 結(jié)論和展望

結(jié)核分枝桿菌已經(jīng)同人類共存并進化了數(shù)千年，由于抗生素的引入，使得長期建立的宿主和結(jié)核分枝桿菌之間平衡關(guān)系被打破?？股氐氖褂脽o疑提高了人類化學(xué)治療感染性疾病的能力，并挽救了無數(shù)人的生命，但短時間內(nèi)接觸大量的抗生素同時也加速了病原菌的進化，使其具備適應(yīng)甚至是抵抗這些抗生素的能力。細菌先天性抵抗化學(xué)藥物的能力遠遠超出人們的想象，除了抗結(jié)核藥靶基因產(chǎn)生快速變異的能力外，結(jié)核分枝桿菌的后備基因幫助其抵抗大多數(shù)已存在的抗生素，甚至包括一些還沒有在市場上出現(xiàn)的新藥。細胞壁天然的抵抗力限制了抗菌藥物接觸到靶位，而藥物反應(yīng)調(diào)節(jié)器調(diào)控著許多具有抗生素抵抗作用的結(jié)構(gòu)蛋白，組成了內(nèi)部防御系統(tǒng)。除了抗藥能力外，結(jié)核分枝桿菌還利用眾多的分子機制來抵擋宿主的防御作用。這些藥物抵抗系統(tǒng)其實提供了一些可能的新藥靶位，同樣也可能很快產(chǎn)生新的耐藥機制。

目前，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展為抗結(jié)核藥物的發(fā)現(xiàn)帶來了前所未有的機遇。通過對結(jié)核分枝桿菌固有抵抗藥物和宿主免疫防御分子機制的深入了解，來篩選靶位設(shè)計藥物。同時，宿主體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境決定了抗菌藥物的治療效果，宿主的免疫機制、基因易感性和營養(yǎng)狀況都會影響治療的結(jié)果和疾病的復(fù)發(fā)，因此將結(jié)核分枝桿菌的研究同宿主以及抗菌藥物聯(lián)系起來，作為一個整體來研究，將會取得更大的進展。

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