陳 哲，胡永紅，涂勝豪

(華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430030)

研究報(bào)告

Wistar大鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎造模因素的分析

陳 哲，胡永紅，涂勝豪

(華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430030)

目的 通過(guò)比較不同的造模方法，分析影響膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen－induced arthritis，CIA)大鼠模型建立的因素。方法選用Wistar大鼠造模，通過(guò)改變性別、劑量、年齡、注射部位及免疫方式，來(lái)比較造模成功率。結(jié)果不同性別、劑量、年齡及免疫方式造模成功率不同。結(jié)論4～5周齡Wistar雌性大鼠，初次免疫注射乳劑4點(diǎn)共0.20 mL，加強(qiáng)免疫在14 d之后3點(diǎn)共0.15 mL的造模成功率最高。

膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎;Wistar大鼠;模型

膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型是Trentham于1977年創(chuàng)立的［1］。隨著研究的不斷深入和實(shí)驗(yàn)的大量重復(fù)，該模型得到充分的發(fā)展和完善，已被公認(rèn)為是研究人類(lèi)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的經(jīng)典模型，國(guó)內(nèi)對(duì)該模型的研究尚未完全開(kāi)展起來(lái)。造模過(guò)程中很多因素會(huì)影響到造模成功率，導(dǎo)致相關(guān)實(shí)驗(yàn)的不能順利進(jìn)行。本研究在參考國(guó)內(nèi)外經(jīng)典文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)與本院風(fēng)濕病實(shí)驗(yàn)室合作，三年來(lái)不斷改進(jìn)造模方法和劑量來(lái)分析影響成模率的因素，以建立更為穩(wěn)定可靠CIA模型的方法。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及試劑

1.1.1 動(dòng)物:Wistar大鼠，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供［SCXK(鄂)2003～0005］。

1.1.2 試劑:牛Ⅱ型膠原(10 mg，5 mL/支裝)、不完全弗氏佐劑(5 mL/支)均購(gòu)于Chondrex公司。

1.2 方法

1.2.1 不同性別對(duì)造模的影響:選用60只大鼠，4～5周齡，體重170±10 g，雌雄各半，分為二組，一組為雌鼠，另一組為雄鼠。根據(jù)造模方法［1］:將牛Ⅱ型膠原10 mg與等體積的不完全弗氏佐劑充分乳化，在無(wú)菌條件下，按每點(diǎn)皮下注射乳劑0.05 mL，初次免疫在大鼠背上任選3點(diǎn)，加強(qiáng)免疫于2周后同法2點(diǎn)注射。在確定對(duì)比存在差異情況下，選擇模型成功率高的性別組作為其余大鼠的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，同時(shí)其余組大鼠的性別與之相同，標(biāo)準(zhǔn)組記為A組。

1.2.2 不同劑量對(duì)造模的影響:選用60只大鼠，4～5周齡，體重體重170±10 g，分為二組，每組各30只。在無(wú)菌條件下，按每點(diǎn)皮下注射乳劑0.05 mL，第一組初次免疫在大鼠背上任選2點(diǎn)，加強(qiáng)免疫于2周后同法1點(diǎn)注射，記做 B1組;第二組初次免疫在大鼠背上任選4點(diǎn)，加強(qiáng)免疫于2周后同法3點(diǎn)注射，記為B2組。

1.2.3 不同年齡對(duì)造模的影響:選用60只大鼠，分為二組，每組各30只，第一組鼠12～13周齡，體重250±10 g，記為 C1組;第三組老齡鼠，20 ～21周齡，體重310±10 g，記為 C2組。根據(jù)造模方法［1］，不做改進(jìn)。

1.2.4 不同注射部位對(duì)造模的影響:選用30只大鼠，4～5周齡，體重170±10 g，在無(wú)菌條件下，按每點(diǎn)皮下每點(diǎn)注射乳劑0.05 mL，初次免疫在大鼠背上任選2點(diǎn)，尾根部1點(diǎn)，加強(qiáng)免疫于2周后分2點(diǎn)注射，背上任選1點(diǎn)，尾根部1點(diǎn)，記為D組。

1.2.5 加強(qiáng)免疫對(duì)造模的影響:選用60只大鼠，4～5周齡，體重170±10 g，分為二組，每組各30只。在無(wú)菌條件下，按每點(diǎn)皮下注射乳劑0.05 mL。第一組免疫一次，大鼠背上任選5點(diǎn)，記為E1組;第二組初次免疫在大鼠背上任選3點(diǎn)，加強(qiáng)免疫于4周后同法2點(diǎn)注射，記為E2組。

1.2.6 模型成功評(píng)定標(biāo)準(zhǔn):采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分法評(píng)定［2］，評(píng)定依據(jù)為關(guān)節(jié)紅腫程度和范圍以及關(guān)節(jié)腫大和變形情況。0分:無(wú)紅腫;1分:趾關(guān)節(jié)稍紅腫，足爪或足墊單個(gè)區(qū)域炎癥;2分:關(guān)節(jié)輕度紅腫，足爪或足墊或踝關(guān)節(jié)兩個(gè)區(qū)域以上的炎癥;3分:關(guān)節(jié)中度紅腫，輕度功能障礙;4分:關(guān)節(jié)嚴(yán)重紅腫，僵直甚至畸形，嚴(yán)重功能障礙。關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分越高，關(guān)節(jié)癥狀越嚴(yán)重，每只足4分，最高積分16分。積分超過(guò)6分即認(rèn)為造模成功。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，不同組間比較用χ2檢驗(yàn)，如果理論頻數(shù) ＜1或者總樣本量＜40，用Fisher’s精確概率法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同性別對(duì)造模的影響

雌性Wistar大鼠組成模18只，未成模12只，而雄性組大鼠成模6只，未成模24只，二組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，說(shuō)明雌性大鼠造模成功率要明顯高于雄性大鼠。因此將雌性組選作標(biāo)準(zhǔn)組。

2.2 其他因素對(duì)造模的影響

低劑量乳化組(B1)成模3只，未成模27只，與B1組比較，標(biāo)準(zhǔn)組造模成功率明顯高于膠原乳劑量為0.15 mL組(P＜0.01);高劑量乳化組(B2)成模25只，未成模5只，與 B2組比較，標(biāo)準(zhǔn)組造模成功率低于膠原乳劑量為0.35 mL組(P＜0.05)。成年大鼠組(C1)成模8只，未成模22只，與C1組比較，標(biāo)準(zhǔn)組造模成功率組明顯高于成鼠組(P ＜0.01);老齡大鼠組(C2)成模2只，未成模28只，與C2比較，標(biāo)準(zhǔn)組造模成功率組也明顯高于老齡鼠(P＜0.01);不同免疫部位組(D)成模20只，未成模10只，標(biāo)準(zhǔn)組與 D組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)，說(shuō)明不同注射部位對(duì)造模成功率影響不明顯;免疫一次組(E1)成模4只，未成模26只，標(biāo)準(zhǔn)組與E1組比較，標(biāo)準(zhǔn)組造模成功率明顯高于無(wú)加強(qiáng)組(P＜0.01);第4周加強(qiáng)免疫組(E2)成模6只，未成模24只，標(biāo)準(zhǔn)組與E2組比較，標(biāo)準(zhǔn)組造模成功率也明顯高于4周加強(qiáng)組(P＜0.01)。綜上結(jié)果可以看出:B2組造模成功率最高，造模成功率可達(dá)到83.3%。

3 討論

CIA模型的誕生源于Trentham發(fā)現(xiàn)RA患者血清及滑液中存在抗膠原抗體，認(rèn)為這種對(duì)膠原組織的自身免疫反應(yīng)可以解釋RA的系統(tǒng)性受累和慢性持續(xù)性發(fā)展的特點(diǎn)。CIA的發(fā)病機(jī)理研究得較為深入，包括體液免疫和細(xì)胞免疫兩個(gè)方面。Ⅱ型膠原分子主要分布于軟骨和眼玻璃體中，由三條Ⅱ型 α鏈組成，每α條鏈中含有重復(fù)的三聯(lián)體系列(甘－XY)，三條Ⅱ型α鏈互相纏繞形成α螺旋，不同物種的Ⅱ型膠原分子結(jié)構(gòu)不同。異種動(dòng)物Ⅱ型膠原注入動(dòng)物體內(nèi)后，產(chǎn)生抗Ⅱ型膠原抗體，因此而誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。用CIA動(dòng)物的血清或提取的抗體注入裸鼠或?qū)IA不敏感的動(dòng)物，可誘發(fā)短暫和較輕的關(guān)節(jié)炎，證明了抗Ⅱ型膠原抗體對(duì)CIA的重要性。然而，并不是所有產(chǎn)生抗Ⅱ型膠原抗體的動(dòng)物都出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎，抗體滴度與關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度也不成正比，這說(shuō)明CIA的發(fā)病原因并非單一的體液免疫可解釋［3］。在細(xì)胞免疫中，T細(xì)胞上的 CD4分子和 T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別與抗原片段結(jié)合的MHC分子，分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)針對(duì)此抗原的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。因此 T細(xì)胞在 CIA的發(fā)病中起重要作用，缺乏T細(xì)胞的裸鼠不能誘發(fā) CIA，使用具有抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)作用的環(huán)孢菌素處理CIA動(dòng)物，關(guān)節(jié)炎不能進(jìn)入慢性階段，且對(duì)第二次致敏不敏感，說(shuō)明 T細(xì)胞對(duì) CIA的持續(xù)發(fā)展起重要作用［4］。

國(guó)內(nèi)外對(duì)CIA模型的研究多集中在于發(fā)病機(jī)理和治療方面的研究，很少有學(xué)者提及造模過(guò)程中的模型成功率問(wèn)題，實(shí)際上建立CIA模型是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，往往造模成功率不高，這直接影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，還會(huì)造成不必要的損失。

影響CIA模型建立有很多因素，本實(shí)驗(yàn)就是通過(guò)對(duì)不同大鼠性別、年齡以及實(shí)驗(yàn)中藥物劑量和注射方法的研究，探討它們對(duì)造模成功率影響，從而摸索一個(gè)成熟的造模方法。研究表明，雌性較雄性大鼠更容易誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎，這一點(diǎn)也與人類(lèi)患類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎女性約占75%相似，但也有研究表明，在易感品系DBA－/1、B10.RⅢ小鼠，雄性的CIA發(fā)生率及嚴(yán)重性較雌性高［5］，這說(shuō)明不同品系的老鼠，性別差異直接影響造模成功率。劑量對(duì)造模也有影響，最佳給藥劑量是初次免疫0.20 mL，加強(qiáng)免疫0.15 mL，共0.35 mL，這要比經(jīng)典的造模方式劑量要稍大，當(dāng)減少免疫劑量時(shí)，總注射量為0.15 mL時(shí)，發(fā)現(xiàn)造模成功率明顯下降(P＜0.01)，然而，對(duì)于造模成功率是否隨免疫劑量增大而增高，這仍需要進(jìn)一步研究。大鼠年齡對(duì)造模的影響也非常明顯，幼鼠明顯比大齡鼠更加容易誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(P ＜0.01)。注射部位對(duì)造模影響不明顯(P＞0.05)，這說(shuō)明膠原的激發(fā)免疫作用與部位無(wú)關(guān)。另外，加強(qiáng)免疫對(duì)于造模也很關(guān)鍵，在第14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫效果最佳。總之，在選擇 CIA模型時(shí)，最好的造模方式是:選擇4～5周齡Wistar雌性大鼠，初次免疫注射乳劑4點(diǎn)共0.20 mL，加強(qiáng)免疫在14 d之后注射乳劑3點(diǎn)共0.15 mL，免疫膠原總量為0.35 mL，經(jīng)過(guò)我們反復(fù)的驗(yàn)證，這種造模方法的模型成功率可以達(dá)到83.3%。

另外，由于受實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種系的限制，我們沒(méi)有對(duì)其它種系的大鼠納入實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，而僅選用了最常見(jiàn)的Wistar大鼠。但有研究表明小鼠 DBA－/1、NFR/N、B10.G等近交系易患 CIA，患病率可達(dá)100%，程度也較重，而另一些種系的小鼠如 B10、B10.P、B10.D2等用Ⅱ型膠原卻不能誘發(fā)關(guān)節(jié)炎［6］。研究表明 MHC表現(xiàn)為 H2－r、H2－q的小鼠對(duì)CIA敏感，而另有一些基因作用卻相反:H2Ebd、H2Ebs基因?qū)π∈笥斜Ｗo(hù)作用［7］。

總之，隨著人們對(duì) RA和 CIA的深入研究，發(fā)現(xiàn)二者存在許多類(lèi)似之處，如滑膜增生、血管翳形成及隨之出現(xiàn)的軟骨及骨破壞，侵犯肢體遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)，對(duì)膠原的體液和細(xì)胞的免疫反應(yīng)，與MHC的關(guān)系等。雖然CIA是一種實(shí)驗(yàn)誘發(fā)的疾病，不出現(xiàn)病情的波動(dòng)和復(fù)發(fā)情況，也沒(méi)有 RA的皮下結(jié)節(jié)、漿膜炎、血管炎等表現(xiàn)，不出現(xiàn)類(lèi)風(fēng)濕因子及抗核抗體，說(shuō)明CIA仍非RA的完美的模型，但是它已是目前公認(rèn)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的最佳模型。

［1］ Trentham DE，Townes AS，Kang AH.Autoimmunity to type II collagen an experimental model of arthritis［J］.J Exp Med，1977，146(3):857－868.

［2］ 湯文璐，李俊，徐叔云，等.Ⅱ型膠原關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的研究概況［J］.中國(guó)藥理學(xué)報(bào)，1998，14:495－498.

［3］ Stuar JM，Crtet MA，Kang AH，et al.Collagen－induced arthritis in rats.Evaluation of early immunologic events［J］.Arthritis Rheum，1979，22(12):1344－1351.

［4］ Takagishi K，Hotokebuchi T，Arai K，et al.Collagen arthritis in rats:the importance of humoral immunity in the initiation of the disease and perpetuation of the disease by suppressor T cell［J］. Int Rev Immunol，1998，4(1):35－48.

［5］ William RO.Rodent models of arthritis:relevance for human disease［J］.Clin Exp Immunol，1998，114(3):330－332.

［6］ Holmdahl R，Andersson M，Enander I，et al.Nature of the typeⅡ collagen autoimmunity in mice susceptible to collagen－induced arthritis［J］.Int Rev Immunol，1988，4(1):49－64.

［7］ Gonzalez－Gay MA，Zanelli E，Krco CJ，et al.Polymorphism of the MHC classⅡ Eb gene determines the protection against collagen－induced arthritis［J］.Immunogenetics，1995，42 (1):35－40.

Analysis of the Influential Factors in Establishing Collagne-induced Arthritis in Wistar Rats

CHEN Zhe，HU Yong－h(huán)ong，TU Sheng－h(huán)ao
(Department of Integrated Chinese Traditional and Western Medicine，Tongji Hospital，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China)

ObjectiveTo analyze the parameters that influence the establishment of collagen－induced arthritis. Methods We compared the success rates of CIA model establishment in the Wistar rats with alternative gender，age，administration dose，injection sites and immune pattern。ResultsThe success rates of CIA model establishment differed in the Wistar rats with different administration dose，age，injection sites and immune pattern。Conclusions Female Wistar rats aged 4～5 weeks with a primary immune injection of 0.20 mL in 4 sites，and booster with 0.15 mL after 14 days in 3 sites exhibited highest success rate.

Collagen－induced arthritis;Wistar rat;Model

R－332

A

1671－7856(2010)05－0029－03

2009－12－04

陳哲(1980－)，男，博士生，從事中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕病學(xué)專業(yè)。

胡永紅(1953－)，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，從事風(fēng)濕病學(xué)臨床和基礎(chǔ)研究。E－mail:yhhu@tjh.tjmu.edu.cn