許崇利，楊 梅，許崇波

（1.吉林化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，吉林吉林 132022；2.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 116622）

隨著世界分子生物學(xué)研究不斷深入。基因表達技術(shù)有了很大的提高。迄今為止，人們已經(jīng)研究開發(fā)出多種原核和真核表達系統(tǒng)用以生產(chǎn)外源蛋白。在各種表達系統(tǒng)中，其中大腸桿菌表達系統(tǒng)因其遺傳背景清楚，低成本，高生產(chǎn)率，特征明確，兼容多種抗體使之成為目前最常用的外源蛋白原核表達系統(tǒng)。盡管大腸桿菌有眾多的優(yōu)點，但并非每一種基因都能在其中有效表達。這歸因于每種基因都有其獨特的結(jié)構(gòu)、mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率、宿主細胞蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解、外源基因和E.coli在密碼子利用上的主要差別以及蛋白質(zhì)對宿主的潛在毒性等。因此本文將就外源基因本身特性和表達系統(tǒng)的特性及其他因素等方面闡明外源基因高效表達的影響因素，從而為大腸桿菌表達系統(tǒng)高效表達外源蛋白提供參考。

1 外源基因本身的特性對表達的影響

1.1 外源基因結(jié)構(gòu)

外源基因包括原核基因和真核基因兩大類。其中原核基因可以在大腸桿菌中直接表達，而真核基因與原核基因不同，它是斷裂基因，基因組DNA中的基因是不連續(xù)的，含有內(nèi)含子序列，大腸桿菌對轉(zhuǎn)錄出的前體mRNA不能進行剪切形成有功能的mRNA，故不能在大腸桿菌中直接表達，而只能以cDNA的形式在大腸桿菌中表達[1-2]。而且由于真核轉(zhuǎn)錄和翻譯元件不能為大腸桿菌識別，必須提供大腸桿菌識別的轉(zhuǎn)錄及翻譯元件以保證真核基因的表達。如真核基因的前導(dǎo)肽不能被大腸桿菌識別發(fā)生正確的剪切，因此在設(shè)計真核基因時應(yīng)去除前導(dǎo)肽序列，必要時換以原核的信號肽序列。真核基因產(chǎn)物除帶有前導(dǎo)肽外，許多蛋白質(zhì)都是以無活性的前體蛋白的形式表達，通過翻譯后的加工才能成為活性狀態(tài)，因此在設(shè)計基因時應(yīng)從活性蛋白質(zhì)編碼序列開始[3-5]。

1.2 外源基因密碼子的選擇使用

原核生物中，由于不同tRNA含量上的差異產(chǎn)生了對密碼子的偏愛性。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：AGA、AGC、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA、GTC8種密碼子是大腸桿菌的稀有密碼子[6]。蛋白翻譯過程中，如果稀少密碼子連續(xù)出現(xiàn)，會抑制蛋白質(zhì)合成，發(fā)生密碼子錯配[7]。因此對含較高比例稀有密碼子的外源基因進行表達時，應(yīng)針對密碼子的偏愛性采取措施，如用非連續(xù)性多核苷酸定點突變方法對cDNA中稀有密碼子進行同義突變，或提高某種氨基酸的tRNA濃度。G Srimivasan[8]等報道Methanosarcina barkeri甲胺轉(zhuǎn)甲基酶基因中UAG密碼子編碼了一個賴氨酸衍生物，故在重組蛋白表達時應(yīng)避免使用UAG作終止密碼子，防止轉(zhuǎn)錄過程的通讀。已知大腸桿菌格外偏愛終止密碼子UAA，尤其當(dāng)在其下游連上一個U而形成UAAU四聯(lián)核苷酸的情況下，轉(zhuǎn)譯終止的效率會進一步加強[9]。

1.3 RNA的一級與二級結(jié)構(gòu)的影響

外源基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA一級與二級結(jié)構(gòu)與外源蛋白的合成有很大關(guān)系，也是影響表達效率的重要因素之一[10]。mRNA一級結(jié)構(gòu)對翻譯效率的影響已有較多研究。轉(zhuǎn)錄出的mRNA 5′上游的SD序列與ATG之間的堿基數(shù)目和堿基組成對目的基因的翻譯效率也很重要。有報道[11]認為，間距以6~11個堿基為最好，而堿基組成以C+G比例不超過50%為好。影響外源基因在大腸桿菌中表達的另一個因素是翻譯起始區(qū)（TIR）的二級結(jié)構(gòu)，TIR指一切與翻譯起始有關(guān)的順式序列，包括RBS及其它參與二級結(jié)構(gòu)形成并影響翻譯的序列。降低TIR二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性可以提高翻譯起始效率，提高mRNA穩(wěn)定性，有利于外源基因表達[12]。沈蕓等[13]通過改變原有載體的TIR區(qū)域的序列，成功開發(fā)出一個高效表達載體。

2 表達系統(tǒng)的特性對于表達的影響

2.1 表達載體的選擇

目前已知的大腸桿菌表達載體至少有以下幾種[14]：非融合型表達、融合型表達、分泌型表達。非融合型表達優(yōu)點在于：表達的非融合蛋白與天然狀態(tài)下存在的蛋白在結(jié)構(gòu)、功能以及免疫原性等方面基本一致，可以進行后續(xù)研究。為了提高翻譯效率，人們在設(shè)計表達載體時采用了許多辦法[15]：①優(yōu)化翻譯起始區(qū)以達到高效表達；②構(gòu)建一套SD-AUG間隔不等的表達載體以供選擇利用[16]；③在構(gòu)建表達載體時，使用近年來發(fā)現(xiàn)的“原核翻譯增強子”序列，以提高翻譯效率[17]；④將“原核翻譯增強子”和雙順反子結(jié)構(gòu)結(jié)合到一起，從而提高表達效率。此外應(yīng)用標(biāo)簽技術(shù)構(gòu)建帶純化標(biāo)記的載體可提高純化純度，為生產(chǎn)高純度高活性的基因工程產(chǎn)品創(chuàng)造了有利條件。

融合表達載體表達蛋白的一般模式為，原核啟動子-SD序列-起始密碼子-原核結(jié)構(gòu)基因片斷-目的基因序列-終止密碼子。目前成功的融合表達載體包括：GST（谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶）系統(tǒng)、半乳糖苷酶系統(tǒng)、麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）系統(tǒng)、蛋白A系統(tǒng)等[18]。由于翻譯起始信號在調(diào)控翻譯強度中是最重要的，融合表達載體通常SD-AUG間隔已固定，翻譯起始信號組織合理，有利于翻譯起始，且簡化了蛋白分離純化步驟。將分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)以融合蛋白形式表達，可增強mRNA及表達產(chǎn)物穩(wěn)定性，并生產(chǎn)出可溶性蛋白。

為減少外源蛋白在宿主體內(nèi)被蛋白酶降解，或者使蛋白質(zhì)能夠在體外正確折疊和便于提純，常將被表達的蛋白質(zhì)分泌到細胞外，因此要用分泌型載體，表達分泌蛋白是防止宿主菌對表達產(chǎn)物的降解，減輕宿主細胞代謝負荷及恢復(fù)表達產(chǎn)物天然構(gòu)象的最有力措施[19]。然而外源蛋白分泌表達是一個非常復(fù)雜的過程，常常會遇到諸如不完全的跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運[20]、轉(zhuǎn)運裝置的容量不足[21-22]。許多因素，包括外源蛋白的大小[23-24]、氨基酸組成[25]及導(dǎo)肽的類型[26]都會對蛋白的轉(zhuǎn)運造成影響。為獲得外源蛋白的高效分泌表達，應(yīng)盡量優(yōu)化翻譯水平，使其與大腸桿菌的轉(zhuǎn)運裝置的容量保持一致，共分泌表達分子伴侶或向培養(yǎng)基中加入低分子量的添加劑，往往會提高外源蛋白在細胞周質(zhì)內(nèi)分泌表達的水平[27-28]。

2.2 啟動子的結(jié)構(gòu)對表達效率的影響

表達載體應(yīng)含有一個嚴格調(diào)控的強啟動子，適用于較大范圍的誘導(dǎo)物濃度。嚴格調(diào)控能防止其他蛋白的表達所誘發(fā)的菌體內(nèi)源性蛋白水解酶的釋放及細菌的自溶[29-30]。強啟動子可以應(yīng)用于較大濃度范圍的誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)表達。

大多數(shù)大腸桿菌啟動子都含有兩種保守區(qū)，即-10區(qū)（位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游5~10 bp，故稱為-10區(qū)，序列為5'-TATAAT）和-35區(qū)（位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游25 bp處，一般有10 bp組成，5'-TTGACA故稱為-35區(qū)）。當(dāng)然，實際的啟動子中很少具備與上述序列完全一致的區(qū)域，但是研究表明，啟動子的這兩個區(qū)域與上述保守序列的相似程度越高，該啟動子的表達能力也就越強。另外，這兩個保守區(qū)間的距離也是影響啟動子強度的重要因素，即這個間距越是接近于17 bp，啟動子的活性就越強。所以在構(gòu)建新的表達載體時要考慮到這一因素的影響。

2.3 宿主菌的選擇

表達宿主菌株的選擇也是在原核蛋白表達過程中必須要綜合考慮的因素。不同的載體適合不同的宿主菌，同種載體在不同的宿主菌中的表達速率并不相同，有時甚至不能表達，并且不同宿主菌之間的生長速度及表達能力也不相同。

另外由于大腸桿菌自身防御系統(tǒng)的保護作用，使得細胞內(nèi)的重組基因和蛋白可能會被其核酸酶和蛋白酶降解，這種降解作用具有一定的專一性和選擇性。因此，選擇蛋白酶缺失的宿主菌非常有利于重組蛋白的表達。Invitrogen等公司都已經(jīng)開發(fā)出蛋白酶缺陷型菌株，以減少外源蛋白被降解的可能，從而提高重組蛋白的表達水平。

3 外源基因與系統(tǒng)間的相互作用

3.1 表達基因的調(diào)控

在表達過程中，過早的表達產(chǎn)物對于宿主菌有毒害作用，是生長速率下降，甚至導(dǎo)致宿主菌死亡，故應(yīng)采用誘導(dǎo)型的啟動子，以便有效的控制表達的時間。因此，對于這種工程菌一般采用兩階段培養(yǎng)法，即菌體積累階段和產(chǎn)物表達階段。

3.2 宿主菌對于質(zhì)粒拷貝數(shù)及穩(wěn)定性的影響

Engberg[31]發(fā)現(xiàn)宿主菌生長速率增大，質(zhì)粒的拷貝數(shù)下降可能因為高生長速率下質(zhì)粒的復(fù)制速度跟不上細胞的分裂速率所致，甚至可能導(dǎo)致質(zhì)粒的丟失。Jones[32]研究了營養(yǎng)限制連續(xù)培養(yǎng)中營養(yǎng)對拷貝數(shù)的影響，連續(xù)培養(yǎng) 8 d，質(zhì)粒（PbR322 和 PMBg）沒有丟失，但拷數(shù)下降了4~5倍，說明營養(yǎng)的限制和缺乏會引起質(zhì)粒的拷貝數(shù)下降。

4 培養(yǎng)條件的控制

培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)基成分、溫度的選擇、誘導(dǎo)條件以及培養(yǎng)時間等等。培養(yǎng)基各組分的濃度和比例要適當(dāng)，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，易于細菌的生長和表達。但過量的營養(yǎng)物質(zhì)會抑制細菌的生長，特別是碳源和氨源的比例。在大腸桿菌表達系統(tǒng)中，理想的條件是含有適量的 Mg2+、K+、NH4+，高濃度的Ca2+和多胺類，以及充足的ATP和GTP可以顯著降低蛋白質(zhì)合成中的錯讀。溫度的影響也很重要，大腸桿菌的最適生長溫度為37℃，溫度較低對包涵體表達有利，但不適于菌體的生長；而在最適溫度下，菌體生長良好，但因能量過多地用于菌體生長，反而對包涵體的表達不利，最佳誘導(dǎo)溫度隨產(chǎn)物不同而異。一般來說，在25℃至37℃誘導(dǎo)，外源蛋白易于以活性存在，在37℃ 以上誘導(dǎo)，則易形成包涵體。要選擇適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)時間來誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)時間的不同會影響到外源基因的表達以及工程菌的穩(wěn)定性和活性。提早誘導(dǎo)造成生物質(zhì)和目的蛋白產(chǎn)量偏低，同時也增加了染菌的機會，而誘導(dǎo)較晚雖可獲得高產(chǎn)量的生物質(zhì)，但細胞表達外源蛋白的時間則減少。細菌在對數(shù)生長期，即OD600為0.6附近時，生長狀況良好，易于誘導(dǎo)而合成外源蛋白。另外，表達產(chǎn)物的后加工雖不涉及到外源基因的表達，但是采取適當(dāng)?shù)姆椒◤陌w得到活性蛋白，可以提高產(chǎn)物的回收率。

總之，研究提高外源基因在E.coli中表達效率的工作已進行的十分廣泛，被發(fā)現(xiàn)的影響表達效率的因素也很多，它們之間有很大的相關(guān)性，單單改進其中一個方面往往不能取得明顯的效果，有時還存在一定的機遇性。但是，認識到各因素的產(chǎn)生和作用的方式，就能夠提出改進表達效率的方法。這方面工作的深入研究有很深遠的理論意義和應(yīng)用價值。

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