熊艷蕾 綜述 賈心善 審校

肺癌是當(dāng)今世界上對人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤之一，肺癌的發(fā)病率和死亡率近年來呈明顯上升趨勢，嚴重威脅著人類健康。在我國的許多省市和地區(qū)，肺癌的發(fā)病與死亡近十年來一直居惡性腫瘤之首位。雖然臨床上已經(jīng)聯(lián)合應(yīng)用手術(shù)、化療、放療等治療方案，但肺癌患者五年生存率仍不高，尋找新的治療途徑可能有利于肺癌的預(yù)后。

依據(jù)腫瘤干細胞理論推斷，肺癌可能是一種干細胞疾?。壕哂凶晕腋潞蜔o限增殖能力的肺癌干細胞是肺癌發(fā)生的根源；肺癌的復(fù)發(fā)、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥、抗輻射等惡性表型特征都與肺癌干細胞有關(guān)。本文綜合了肺癌干細胞最新研究進展及其在肺癌形成中的重要作用，同時為肺癌治療提供了新的思路。

1 肺癌干細胞的發(fā)現(xiàn)與分離

1.1 利用細胞表面的分子標記分選肺癌干細胞 Kim等[1]利用流式細胞儀從大鼠細支氣管和肺泡管結(jié)合部（the bronchioalveolar duct junction, BADJ）分離出一群CD45+/Pecam-/Sca-1+/CD34+細胞，其在正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)體內(nèi)支氣管和肺泡損傷時發(fā)生增殖，能夠分化為其他類型的肺上皮細胞，表現(xiàn)出明顯的自我更新特性，Kim將其命名為支氣管肺泡干細胞（bronchoalveolar stem cells, BASCs）。體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)K-ras基因（原癌基因）激活可導(dǎo)致BASCs增殖更新；成鼠體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)BASCs在肺癌發(fā)生早期可出現(xiàn)數(shù)目增多和體積增大，與肺癌起始有關(guān)，被認為是肺腺癌的靶細胞。最近，Regala等[2]發(fā)現(xiàn)非典型蛋白激酶C （protein kinase C, PKC ）的激活可促進BASCs增殖和向肺癌干細胞的轉(zhuǎn)化。

Eramo等[3]則認為肺癌干細胞屬于CD133+細胞，然而上述類型肺癌干細胞的致瘤性較弱，在NOD-SCID免疫缺陷小鼠皮下需植入1×104個CD133+細胞才能形成腫瘤，這些肺癌干細胞是否具有小鼠BASCs特征，目前尚不清楚。但最近有學(xué)者對此提出異議[4]，他們應(yīng)用免疫磁珠從A549和H446肺癌細胞系中分離出CD133+細胞和CD133-細胞，二者均具備相似的自我更新、侵襲及耐受化療藥物能力。此外，40%以上的CD133+細胞和CD133-細胞均可形成較大克隆，這提示僅表達CD133尚不能作為A549和H446細胞系干細胞的標記物。Hayashi等[5]檢測了CD133在小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）細胞系內(nèi)表達，發(fā)現(xiàn)CD133幾乎僅表達于小細胞肺癌細胞系，在非小細胞肺癌細胞系內(nèi)很少表達，且CD133+小細胞肺癌細胞致瘤能力均強于非小細胞肺癌，但由于CD133表達過于廣泛，不應(yīng)作為分選肺癌干細胞的標記物。

最近Chen等[6]從肺癌標本及肺癌細胞系中分離出了CD133+肺癌細胞（LC-CD133+）和CD133-肺癌細胞（LCCD133-），并發(fā)現(xiàn)高表達OCT4基因的LC-CD133+有明顯自我更新能力和無限增殖潛能，體內(nèi)外放化療實驗均表明，LC-CD133+對放化療抵御能力與OCT4基因表達有關(guān)，OCT4是參與調(diào)控胚胎干細胞自我更新和維持其全能性的最為重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，同時也是體外建立誘導(dǎo)多功能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPS）的關(guān)鍵基因，作者推斷OCT4基因?qū)τ诰S持 LC-CD133+的干細胞特性和耐化療能力有重要意義。

Giangreco等[7]認為位于近端氣道粘膜下腺體/內(nèi)軟骨環(huán)、神經(jīng)上皮小體和終末細支氣管/支氣管肺泡交叉處的氣道干細胞具有致癌特性，如高增殖能力、多向分化潛能和較長存活壽命。

美國學(xué)者[8]應(yīng)用流式細胞儀從人類肺癌細胞系中分選出醛脫氫酶-1（aldehyde dehydrogenase 1, ALDH1）陽性的細胞，發(fā)現(xiàn)其具備諸多干細胞特征，并表達CD133；體內(nèi)實驗證明：ALDH1+細胞具備可形成與母代細胞異質(zhì)性相同的腫瘤。此外，免疫組織化學(xué)分析303例臨床標本發(fā)現(xiàn)ALDH1的表達與肺癌的分期和分級以及患者預(yù)后相關(guān)。因此作者大膽推測ALDH1可能是肺癌標記物和肺癌潛在的預(yù)后因子。

1.2 利用側(cè)群細胞分選法分離肺癌干細胞 加拿大學(xué)者Ho等[9]應(yīng)用Hoechst33342染色和熒光激活細胞分選方法，在6種肺癌細胞株（A549, H460, H23, HTB-58, H441, H2170）中分離出側(cè)群細胞（side population cell, SP），并證實SP細胞具有自我更新、分化和高致瘤性的特征，并且發(fā)現(xiàn)其具備干細胞“永生”和處于靜止?fàn)顟B(tài)的特征，高表達抗凋亡因子和端粒酶mRNA，而標志細胞增生的MCM7基因mRNA表達下調(diào)。因此他們認為肺癌的腫瘤干細胞主要富集在側(cè)群細胞組分中，表達 ABCG2等ATP結(jié)合盒（ATP binding cassette, ABC）轉(zhuǎn)運蛋白。

Seo等[10]在研究A549人肺腺癌細胞株腫瘤干細胞AKRICI/C2、TM4SFl、NROBI基因表達時，他們利用SP細胞分選法成功將對數(shù)生長期的細胞分離為SP細胞與非SP細胞，并發(fā)現(xiàn)SP細胞AKRICL/C2、TM4SFl、NROBI基因表達上調(diào)并且具備腫瘤干細胞的生物學(xué)特征。

2 肺癌干細胞與肺癌形成

2.1 正常肺臟干細胞突變 從理論上來說，一個正常細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞至少要發(fā)生4-7次突變，這需要幾年或是幾十年的時間。干細胞生存期長、分裂慢，最有可能長期受有害環(huán)境影響積聚突變向腫瘤干細胞轉(zhuǎn)化。肺臟干細胞及前體細胞均有自我更新能力，有充分的時間來接受腫瘤形成所必須的遺傳改變信息。當(dāng)肺內(nèi)正常干細胞自我更新的調(diào)節(jié)機制受損或肺干細胞積累了惡性變傳遞到肺的前體細胞，使其經(jīng)歷突變后重新獲自我更新能力，都會導(dǎo)致肺干細胞無限增生，最終成肺癌[11]。因此，氣管干細胞方面的研究也顯得較為重要。

賈心善等[12,13]應(yīng)用5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil, 5-FU）對離體的人及大鼠氣管造成損傷，建立了氣管干細胞增殖分化動物模型[14]，對氣管干細胞進行了定位研究。結(jié)果顯示：5-FU損傷后，氣管上皮細胞絕大部分脫落，可見少量間隔分布的類似裸核的細胞呈釘狀位于基底膜上，PCNA染色陰性，證明為G0期細胞；去除5-FU后，正是通過這些干細胞增殖分化，修復(fù)了損傷的氣管環(huán)。該實驗室還證實，此G0期細胞能排除Hoechst33342染料，Bcrpl/ABCG2表達陽性[15]，Song等[16]發(fā)現(xiàn)此G0期細胞可表達胚胎干細胞標記物Oct3/4、Nanog和Sox2，進一步證明其為氣管干細胞。此外，該損傷模型還可用于研究氣管損傷修復(fù)過程中某些信號通路的開啟情況及某些細胞因子的變化情況。

雖然干細胞和腫瘤干細胞密切相關(guān)，但應(yīng)該注意到它們有著本質(zhì)的不同[17]，例如腫瘤干細胞自我更新轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負反饋機制已被破壞，傾向于累積復(fù)制的錯誤，而干細胞能夠防止復(fù)制錯誤的發(fā)展。此外，干細胞增殖具有自穩(wěn)定性，其數(shù)目在機體調(diào)控下保持恒定，而腫瘤細胞卻無自穩(wěn)定性的特點。

2.2 肺臟干細胞微環(huán)境調(diào)控異常 干細胞生長的微環(huán)境稱之為干細胞“龕”（niche），它保持干細胞處于休眠狀態(tài)；阻止其分化；保護腫瘤干細胞免于抗癌藥物、放射線的攻擊；通過信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)著腫瘤干細胞的自我更新、分化、凋亡，影響著腫瘤干細胞的遷徙與轉(zhuǎn)移。

研究[18,19]發(fā)現(xiàn)肺癌的形成不僅與肺癌干細胞有關(guān)，肺臟局部微環(huán)境可能也參與肺癌形成，在不同解剖區(qū)域有不同的組織學(xué)表型。鼠類肺癌模型由近端氣管至遠端氣管，大致分布的主要肺癌組織表型為：鱗癌、小細胞肺癌、支氣管肺泡癌。這種在不同解剖區(qū)域有不同表型分布的現(xiàn)象提示：僅有少數(shù)散在分離的細胞及其微環(huán)境支持肺癌生長。K-ras基因變異小鼠模型實驗也證實了這一觀點：盡管整個小鼠氣道細胞都發(fā)生了K-ras基因變異，但是僅位于支氣管肺泡區(qū)域的細胞發(fā)生了腺瘤樣增生。此外，肺腺癌是肺癌最常見的組織類型之一并且在細支氣管和肺泡處多發(fā)。這表明：肺癌的形成不僅與致癌基因突變有關(guān)，還與不同細胞所處的微環(huán)境有關(guān)。利用小鼠鱗癌，腺癌，支氣管肺泡癌模型確定的腫瘤起始位點與最新發(fā)現(xiàn)的氣道干細胞所處的小生境位置似乎一致[20]。

2.3 肺臟干細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制異常 大量實驗研究證明，正常干細胞和腫瘤干細胞具有相似的調(diào)節(jié)性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，一旦正常干細胞自我更新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)紊亂則會導(dǎo)致腫瘤增殖或形成腫瘤。目前已經(jīng)清楚腫瘤干細胞的分化與自我更新受EGF/EGFR、PDGF/PDGFR、Notch和Wnt/β-catenin等通路的調(diào)控[21]。

2.3.1 Wnt通路與肺臟干細胞 Wnt/β-catenin通路可以調(diào)控細胞周期，從而維持干細胞的分化和自我更新。王琳琳等應(yīng)用5-FU大鼠氣管上皮損傷模型，再現(xiàn)了氣管干細胞原位增殖分化修復(fù)氣管上皮的全過程，結(jié)果表明：Wnt-1時間依賴性表達與氣管損傷修復(fù)進程相吻合，Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑參與調(diào)控氣管干細胞增殖分化全過程，修復(fù)早期促進氣管干細胞的增殖，修復(fù)后期促進祖細胞向特定的細胞分化。張菁茹等[22]采用干細胞基因芯片比較受損氣管上皮在恢復(fù)24 h及48 h與正常氣管上皮基因表達的差異。24 h后差異基因8個上調(diào)，31個下調(diào)。48 h后5個上調(diào)，42個下調(diào)。差異基因表達主要集中在細胞周期調(diào)控、細胞連接、FGF、BMP分子、Notch、Wnt信號通路上。在肺干細胞中β-catenin主要通過減弱分化促進組織干細胞數(shù)量的增加，而不是促進干細胞直接增生，其在非小細胞肺癌干細胞中的作用也需要進一步研究[23]。

Mazieres等[24]證實在肺癌細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中存在與上述干細胞相似的Wnt過度表達、非經(jīng)典途徑JNK通路激活和Wnt拮抗劑WIF-1的抑制和失活。Nakashima等研究證實，Wnt-1的過度表達會使肺癌發(fā)生演進。Kim等[25]應(yīng)用轉(zhuǎn)染后含有 Wnt-1抑制因子基因的A549和H460細胞株，測定細胞增生，并將含有Wnt抑制因子的脂質(zhì)體注射到移植瘤。結(jié)果表明Wnt-1抑制因子表達增加可以促進癌細胞的凋亡，使克隆形成率下降，并且重組的Wnt-1抑制因子蛋白能夠抑制 H460的增生，顯著抑制腫瘤的生長。

2.3.2 Notch通路與肺臟干細胞 在非小細胞肺癌干細胞的研究中，敲除小鼠基因的實驗研究[26]表明 Notch通路活化在肺的發(fā)育中起重要作用，并且Notch配體、受體和HES1的水平在非小細胞肺癌細胞株中表達升高，其與癌變的RAS信號關(guān)系密切[27]。應(yīng)用γ-Secretase抑制劑能夠抑制Notch2激活，在體內(nèi)、外均可抑制肺癌的生長[28]。Ma等[29]采用大鼠損傷模型，分析了Notch信號分子Notch-3、Jagged-1和Hey1在氣管干細胞增殖分化過程中的表達。實驗證明，Hey-1的Notch信號在氣管干細胞增殖分化過程中維持氣管干細胞的未分化狀態(tài)，促進氣管干細胞的非分化性增殖。

就肺癌而言，其干細胞和腫瘤形成的關(guān)系正逐步揭曉。理論上，我們認為，上述三個條件在肺癌形成過程中均發(fā)揮了作用，但是其具體發(fā)生及調(diào)控機制目前尚不清楚，有待于進一步研究。

3 肺癌干細胞與臨床治療

3.1 肺癌干細胞可能與耐藥性密切相關(guān) 目前大量的理論和實驗均表明腫瘤干細胞可能與耐藥性密切相關(guān)。與正常干細胞類似，生長緩慢和多處于休眠狀態(tài)有助于腫瘤干細胞耐藥性的產(chǎn)生。此外，腫瘤干細胞表面高表達多種ABC轉(zhuǎn)運蛋白[30]，例如ABCB1基因編碼P2糖蛋白（P-glycoprotein, Pgp）、ABCG2/MXR基因編碼多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multi-drug resistance related protein 1, MRP1）和乳腺癌耐藥蛋白2（bcl-2），它們具備外排藥物、毒物的能力。ABCG2、ABCB1或ABCC1基因敲除的小鼠對長春堿、異阿凡曼菌素、米托蒽醌等藥物更加敏感[31]，提示ABC轉(zhuǎn)運子可保護細胞不受化療藥物影響，也可能經(jīng)過基因突變的積累，腫瘤干細胞把這種多藥耐藥機制遺傳下來；或存在基因突變或分化異常導(dǎo)致復(fù)發(fā)的腫瘤出現(xiàn)了多藥耐藥性，這就可以解釋為什么本來不具有耐藥性的腫瘤在化療后復(fù)發(fā)獲得多藥耐藥性。

Sung等[32]也發(fā)現(xiàn) A549細胞株的側(cè)群細胞亞群有ABCG2基因高表達，且MDR1和ABCC2基因高表達，并證明了其與腫瘤耐藥性有關(guān)。

3.2 肺癌干細胞與肺癌復(fù)發(fā) 肺癌傳統(tǒng)治療方案中，放射療法、化學(xué)藥物療法等被廣泛應(yīng)用于包括肺癌在內(nèi)的各種惡性腫瘤，但是這些手段往往在治療初期效果顯著，但是維持時間短暫且伴有復(fù)發(fā)現(xiàn)象。放化療手段殺傷的靶細胞為增殖活躍的肺癌細胞或定向前體細胞，而休眠的肺癌干細胞往往處于G0期，對射線和化學(xué)藥物不敏感，可以抵御放化療的殺傷，成為以后復(fù)發(fā)的根源[33]，這或許可以解釋當(dāng)前治療惡性腫瘤失敗的原因。因此針對腫瘤干細胞的治療可能效果更持久，靶向去除肺癌干細胞將是治療肺癌的新突破點。

3.3 清除肺癌干細胞的可能策略 研制ABC轉(zhuǎn)運蛋白的阻斷劑進而逆轉(zhuǎn)肺癌干細胞的耐藥性，充分發(fā)揮化療藥物的療效。目前已批準進行臨床研究的ABCG2抑制劑及其它ABCG2抗體的研究等[34]。

通過調(diào)控關(guān)鍵的信號通路來抑制肺癌干細胞的自我更新和誘導(dǎo)分化?？梢酝ㄟ^小分子抑制劑如RNAi技術(shù)阻止這些信號通路的活化來治療腫瘤。目前發(fā)現(xiàn)gamma蛋白分泌酶抑制劑，可以靶向Notch通路來抑制白血病和淋巴瘤細胞的生長[35]。

改善腫瘤干細胞的微環(huán)境 ，特別是血管生成。目前已經(jīng)證實，抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的單克隆抗體-貝伐珠單抗[36]（bevacizumab）對于結(jié)腸癌治療有效。抗血管生成治療已經(jīng)應(yīng)用在非小細胞肺癌的治療中，并使患者的生存獲益[37]。

直接靶定肺癌干細胞，根據(jù)特異性的表面分子標志識別肺癌干細胞，制備單克隆抗體，攜帶放射性物質(zhì)或化療藥物，直接靶向放化療，最終促使肺癌干細胞凋亡，使腫瘤失去生成新的腫瘤細胞的能力，爭取達到根治的目的。通過腫瘤干細胞表面的分子抗原進行靶向殺傷?，F(xiàn)已應(yīng)用于臨床的吉姆單抗（gemtuzumab）/奧佐米星（ozogamicin）是人源化的抗CD133單抗和細胞毒抗腫瘤抗生素刺孢霉素（calicheamicin）的偶聯(lián)物，用于治療復(fù)發(fā)的急性髓性白血病AML。最近發(fā)現(xiàn)抗CD44的單抗可以消除AML干細胞[38]。

4 總結(jié)

肺癌干細胞領(lǐng)域的研究剛剛起步，還有許多問題亟待解決。例如：探尋肺癌干細胞的具體生物學(xué)特性及其標記物、確定腫瘤干細胞與正常干細胞間的差別、明確其具體調(diào)控機制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。但是，這一理論的提出及認定無疑將會是人類攻克肺癌的一大進步，可以解釋肺癌的多種生物學(xué)行為，因此結(jié)合腫瘤干細胞學(xué)說，分析肺癌干細胞的生物學(xué)特性，進而闡明肺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥的機制，有助于肺癌的診斷、治療和預(yù)后評估，有助于篩選靶向性殺傷腫瘤干細胞的藥物，為臨床提供新的治療靶點，將會對肺癌的診斷、治療及預(yù)防產(chǎn)生深遠的影響。