呂鳳霞，陸兆新，別小妹，林謙，張充，曹林，郭瑤，湯彥翀

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 酶工程研究室，南京 210095

血栓栓塞性疾病嚴(yán)重危害人類健康和生命，溶栓療法是治療血栓栓塞性疾病最為有效并且可靠的手段。溶栓療法主要是通過藥物溶解血栓中的主要基質(zhì)血纖維蛋白，或激活血液中無活性的血漿纖溶酶原，形成有活性的纖溶酶來催化血纖維蛋白的水解，使血栓溶解，血管再通。目前臨床應(yīng)用的溶栓藥物有較好的療效，明顯降低了患者的死亡率和致殘率，但還存在特異性不高、半衰期短、易出血及再栓塞等缺點。因此迫切需要研制開發(fā)高效、特異、安全、副作用小、價廉的新型溶栓藥物。已有研究表明，許多中藥具有抗血小板聚集、抗血栓形成的作用，包括生物堿類、黃酮類以及皂甙等化合物[1]，尤其是活血化瘀中草藥具有不同程度的抗凝血、血小板聚集及溶解血栓的作用[2-5]。生活在植物組織內(nèi)的內(nèi)生菌，由于內(nèi)生菌與宿主植物長期協(xié)同進(jìn)化過程中，彼此構(gòu)成了穩(wěn)定的生態(tài)關(guān)系，使內(nèi)生菌具有產(chǎn)生某些與植物相同或相似化合物的能力[6]。因此，從植物內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物中尋找新型溶栓劑具有深遠(yuǎn)理論意義和潛在的應(yīng)用價值。目前，關(guān)于內(nèi)生菌來源纖溶酶的研究報道尚不多見。

本研究室首次從中藥植物組織中篩選分離到一株纖溶活性較高和良好體外溶栓效果的多粘類芽胞桿菌EJS-3[7]。由于從天然產(chǎn)酶菌株中分離纖溶酶不僅產(chǎn)量低而且酶的分離純化過程操作繁瑣，可采用基因工程技術(shù)在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)纖溶酶，進(jìn)一步提高酶的產(chǎn)量，簡化純化過程。

本研究采用PCR方法克隆了內(nèi)生菌多粘類芽胞桿菌纖溶酶PPFE-I，構(gòu)建了pET-DsbA/PPFE-I融合表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21 (DE3) 后獲得可溶性表達(dá)，實現(xiàn)了在大腸桿菌中有活性的表達(dá)，并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化研究，為利用基因工程技術(shù)在原核系統(tǒng)中高效表達(dá)纖溶酶提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

產(chǎn)纖溶酶芽胞桿菌 EJS-3為本室從植物內(nèi)生菌中分離并保存，經(jīng)鑒定為多粘類芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa；E. coli TOP10F'及 E. coli BL21(DE3) plysS為本室保存。表達(dá)載體pET-DsbA為深圳市勤寶升生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品。

1.1.2 工具酶和化學(xué)試劑

限制性內(nèi)切酶BamH I、Bcu I、T4 DNA連接酶購自Fermentas公司；高保真DNA聚合酶Pfu、基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自上海Sangon公司；Western blotting化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)為Amersham公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 二抗購自 Santa CruZ Biotechnology 公司；PVDF (polyvinylidene fluoride)膜、Sephadex G-100為Amersham Biosciences產(chǎn)品；Ni-NTA購自 QIAGEN (德國)。其他試劑均為Ameresco公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆及重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù) GenBank：D00861.1序列，利用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物。P1: 5′-CGCGGATCC ATGATTAAAGTATGGTTTTC-3′ (下劃線部分為BamH I的酶切位點)；P2: 5′-CGGACTAGT TTAGCC TACAGCGTCAAAAG-3′ (下劃線部分為Bcu I的酶切位點)。PCR程序：94℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min ，72℃ 2 min；30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，與克隆載體pMD19-T連接，構(gòu)建克隆載體pMD-PPFE-I，陽性克隆委托上海生工公司測序。再用上述 2種限制性內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒 pMD19-PPFE-I及 pET-DsbA表達(dá)載體后以 T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化 E. coli TOP10F′ 感受態(tài)細(xì)胞，在 LB平板上培養(yǎng)。挑取單個菌落，小量提取質(zhì)粒，酶切及測序鑒定。

1.2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-DsbA/PPFE-I和對照質(zhì)粒pET-DsbA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS，分別挑取單克隆，接入20 mL含氨芐青霉素 (120 μg/mL)和葡萄糖 (0.2%) 的LB培養(yǎng)基，30℃、80 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。以2.5%接種量接入100 mL含氨芐青霉素 (120 μg/mL) 和葡萄糖 (0.2%) 的LB培養(yǎng)基，35℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2~3 h至OD600為0.6時，加入IPTG至終濃度100 μg/mL，于30℃、180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)，不同時間取樣。離心收集各菌體細(xì)胞并超聲破碎，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白的表達(dá)形式，并用纖維蛋白平板法測定其活性。

1.2.3 表達(dá)產(chǎn)物的純化

將10 mL上清液上樣于2 mL 的Ni-NTA親和柱。層析柱預(yù)先用親和緩沖液 (50 mmol/L PBS，0.3 mol/L NaCl，5 mmol/L咪唑，pH 7.4) 平衡10個柱體積，上樣速度為1 mL/min。上樣后用10個柱體積親和緩沖液洗去未吸附的雜蛋白，再用5倍柱體積含有 30 mmol/L咪唑的親和緩沖液洗脫雜蛋白。洗脫大部分雜蛋白后，用3~4倍柱體積的凝血酶緩沖液 (150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，2.5 mmol/L CaCl2，pH 7.9) 平衡柱子，加入2 mL凝血酶緩沖液，再加入50~60 U 凝血酶，22℃酶切8 h后[8]，用約10 mL凝血酶緩沖液將酶切產(chǎn)物沖下，收集酶液，用纖維蛋白平板法測定其活性?；钚詷悠酚肧DS-PAGE電泳檢測，并進(jìn)行蛋白含量的測定。

酶切后的目的蛋白經(jīng)過Sephadex G-100凝膠過濾層析進(jìn)一步純化，用0.1 mol/L PBS (pH 7.4) 緩沖液洗脫，流速0.5 mL/min。收集目的峰，得到重組酶純品，?70℃凍存。

1.2.4 纖溶酶活性測定

重組纖溶酶的纖溶活性檢測參照文獻(xiàn)[9]。

1.2.5 蛋白質(zhì)濃度測定

采用Bradford法[10]，以牛血清白蛋白 (BSA) 為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.2.6 SDS-PAGE電泳檢測

參照Laemmli UK報道的方法[11]進(jìn)行，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%。電泳完畢后，取出凝膠，考馬斯亮藍(lán)染色、脫色。

1.2.7 重組蛋白的Western blotting分析

蛋白純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，使用半干法將SDS-PAGE膠中融合蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗抗PPFE-I抗血清，4℃孵育過夜。PBST洗膜5次，每次10 min，再加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG，37℃溫育1 h，PBST洗膜3次后，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，壓片。

1.2.8 MALDI-TOF-MS檢測

根據(jù) Kussmann的方法[12]對重組酶純品進(jìn)行MALDI-TOF (Time-of-Flight) 質(zhì)譜分析。樣品200 ng/μL，溶解于0.1% TFA，取10 μL與飽和溶解的70% ACN/30% 0.1TFA的介子酸等體積混合。由南京醫(yī)科大學(xué)中心實驗室測定。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆及重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以內(nèi)生多粘類芽胞桿菌ESJ-3總DNA為模板，P1和P2為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴增得到1 770 bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符。PCR擴增片段的序列測定和分析表明，該序列編碼區(qū)長1 770 bp，可編碼 590個氨基酸，該基因編碼的蛋白的分子量為63 414.58 Da；通過與其他纖溶酶的氨基酸序列比對 (圖 1)，發(fā)現(xiàn)本研究得到的基因序列與 Bacillus pseudomycoides纖溶酶 (GenBank Accession No. ACK38255) 的親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)到 65%以上。構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-DsbA/PPFE-I，經(jīng)BamH I和Bcu I雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示2條DNA條帶，一條與質(zhì)粒 pET-DsbA相對分子質(zhì)量相符，約為3 600 bp，另一條與 PCR產(chǎn)物相對分子質(zhì)量一致，約為1 770 bp，證明重組表達(dá)質(zhì)粒pET-DsbA/PPFE-I已構(gòu)建成功，且DNA測序結(jié)果完全正確。

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

將重組質(zhì)粒 pET-DsbA/PPFE-I和空質(zhì)粒pET-DsbA分別轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3) 后，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，不同時間取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，大量表達(dá)出分子量約為88 kDa的蛋白質(zhì)，并且隨誘導(dǎo)時間的增長其表達(dá)量增加(圖2)。這與預(yù)測的融合蛋白大小相同，相當(dāng)于24.7 kDa的DsbA和63.4 kDa的PPFE-I之和。經(jīng)Bandscan軟件分析顯示，表達(dá)的目的蛋白占菌體總蛋白的18.4%。而對照菌pET-DsbA中沒有出現(xiàn)這條帶。同時，該表達(dá)蛋白存在菌裂解液的上清液中，而沉淀中沒有出現(xiàn)表達(dá)區(qū)帶 (圖 3)，這說明該表達(dá)蛋白主要以可溶形式存在。

圖1 Paenibacillus polymyxa EJS-3纖溶酶基因序列的進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of PPFE-I gene.

圖2 重組菌E. coli BL21(DE3)/pET-DsbA-PPFE-I誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of expression products of E. coli BL21/pET-DsbA-PPFE-I. M: protein molecular weight marker; 1: E. coli BL21/pET-DsbA; 2: uninduced E. coli BL21/pETDsbA-PPFE-I; 3?6: E. coli BL21/pET-DsbA-PPFE-I induced by IPTG for 0.5, 1, 1.5 and 2 h, respectively.

圖3 E. coli BL21(DE3)/pET-DsbA-PPFE-I表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析Fig. 3 Solubility analysis of E. coli BL21(DE3)/pET-DsbAPPFE-I expression products. M: protein molecular weight marker; 1: deposit after sonication and centrifugation of E. coli BL21(DE3)/pET-DsbA-PPFE-I; 2: supernatant after sonication and centrifugation of E. coli BL21(DE3)/pET-DsbA-PPFE-I.

用纖維蛋白平板測定表達(dá)產(chǎn)物纖溶活性。PPFE-I重組菌的發(fā)酵上清液在纖維蛋白平板上有明顯的透明水解圈，說明表達(dá)產(chǎn)物具有纖溶活性，而含空載體重組菌為對照，其上清液無透明水解圈(圖4)。纖溶活性測定結(jié)果表明，PPFE-I重組菌發(fā)酵上清液纖溶酶活性達(dá)228 IU/mL。

圖4 纖維蛋白平板法測定纖溶活性Fig. 4 Fibrinolytic activity assay on fibrin plate. 1, 2: supernatant after sonication and centrifugation of E. coli BL21(DE3)/pET-DsbA; 3?8: supernatant after sonication and centrifugation of E. coli BL21(DE3)/pET-DsbA-PPFE-I, respectively.

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的純化和鑒定

經(jīng)上述SDS-PAGE分析，表明pET-DsbA/PPFE-I重組質(zhì)粒在大腸桿菌中可以實現(xiàn)可溶表達(dá)。上清液進(jìn)行 Ni-NTA親和柱純化回收。純化后的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印PVGF膜，用抗PPFE-I抗體進(jìn)行 Western blotting 鑒定。結(jié)果如圖5所示，在88 kDa處有一條特異性條帶，其大小與預(yù)測的融合蛋白是一致的，而E. coli BL21(DE3)/pET-DsbA細(xì)胞裂解液沒有檢測到任何條帶，表明已經(jīng)成功表達(dá)了目的蛋白。

圖5 DsbA-PPFE-I Western blotting分析Fig. 5 Analysis of DsbA-PPFE-I Western blotting. 1, 2: purified fusion protein; 3: pET-DsbA.

上清液經(jīng) Ni-NTA親和柱純化時，雜蛋白大部分可被含有30 mmol/L咪唑的Binding Buffer洗脫，而融合蛋白不被洗脫，融合蛋白在鎳柱上經(jīng)凝血酶酶切 8 h后，收集酶液，用纖維蛋白平板法測定其有纖溶活性，并用SDS-PAGE電泳檢測 (圖6)。

圖6 凝血酶酶切后的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of expression products by thrombin restriction. 1: recombinant enzyme with thrombin digestion; 2: protein molecular weight marker.

由圖6可以看到，融合蛋白經(jīng)凝血酶酶切后，除了63 kDa大小的重組酶，還有其他的雜蛋白存在，需經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾層析進(jìn)一步純化，收集目的峰，得到比活力為2 051 IU/mg的重組酶 (圖7)，用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定純度。質(zhì)譜鑒定如圖8所示，結(jié)果顯示其單同位素峰平均相對分子質(zhì)量為63 334，與預(yù)測的相對分子質(zhì)量63 414基本一致。

圖7 純化產(chǎn)物的纖溶活性測定Fig. 7 Fibrinolytic activity assay of purified expression products on fibrin plate.

圖8 重組酶的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig. 8 MALDI-TOF mass spectrum of the recombinant fibrinolytic enzyme.

3 討論

自從Nakamura等[13]于1992年首次克隆了納豆激酶基因并測定了全基因序列，使得利用基因工程技術(shù)提高纖溶酶活性及產(chǎn)量成為可能。國內(nèi)研究者們相繼對纖溶酶基因如納豆激酶 (NK)、豆豉溶栓酶基因的表達(dá)進(jìn)行探索。本研究采用PCR方法克隆了內(nèi)生多粘芽胞桿菌纖溶酶基因，其推導(dǎo)的纖溶酶氨基酸序列和已經(jīng)報道的納豆激酶、豆豉溶栓酶基因的氨基酸序列相似性只有 30%，與 Bacillus pseudomycoides (Genbank Accession No. ACK38255)纖溶酶相似性最高為65%，所以內(nèi)生多粘芽胞桿菌纖溶酶可能是一種新型的纖溶酶。本研究克隆的基因序列編碼的纖溶酶與已經(jīng)報道的芽胞桿菌纖溶酶的性質(zhì)差異尚需進(jìn)一步探討。

目前對纖溶酶基因表達(dá)的研究較多，主要以纖溶酶基因的原核表達(dá)系統(tǒng)為主，研究結(jié)果也不盡相同，主要在于纖溶酶基因表達(dá)后的產(chǎn)物是否有活性。本研究采用PCR方法克隆了內(nèi)生菌多粘類芽胞桿菌纖溶酶基因，構(gòu)建了pET-DsbA表達(dá)載體，采用T7啟動子和 DsbA基因融合表達(dá)，將構(gòu)建 pET-DsbA/ PPFE-I融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3) 后獲得可溶性表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白占菌體總蛋白的18.4%，纖維蛋白法測定顯示纖溶活性，纖溶酶活性比野生菌高2倍左右，達(dá)228 IU/mL。表達(dá)量和酶活性與張淑梅[14]、Zhang[15]等研究的表達(dá)水平相近。本研究中，盡管表達(dá)產(chǎn)物以可溶性蛋白質(zhì)形式表達(dá)，且具有纖溶活性，但融合蛋白表達(dá)量偏低?？赡茉谟趩幼訌姸群退拗骶倪x擇、質(zhì)粒的拷貝數(shù)、培養(yǎng)條件的控制、mRNA 穩(wěn)定性等幾方面存在問題。此外，本研究中的P. polymyxa EJS-3纖溶酶氨基酸編碼密碼子存在6個稀有密碼子，可能會對該基因在E. coli中的表達(dá)水平產(chǎn)生一定的影響。

金屬螯合層析 (IMAC) 是近年來發(fā)展起來的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，通過在C端或N端添加標(biāo)簽的方法簡化重組蛋白質(zhì)的提取過程。本研究構(gòu)建了pET-DsbA/PPFE-I的重組表達(dá)載體，在表達(dá)產(chǎn)物 N端融合了His-Tag純化標(biāo)簽，故可利用Ni-NTA親和柱來提純表達(dá)出的融合蛋白，同時該載體在 DsbA編碼區(qū) 3′端的下游有一凝血酶酶切位點，因此可用凝血酶在鎳柱上將融合蛋白切割，酶切后得到目的蛋白和DsbA配體，經(jīng)Sephedax G-100進(jìn)一步純化。通過鎳親和層析、凝血酶酶切以及分子篩層析對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化，操作簡單易行，特別是將純化與融合子的去除在Ni-NTA親和柱上一步完成，大大簡化了純化步驟，為重組纖溶酶的生產(chǎn)提供了依據(jù)。

致謝：MALDI-TOF-MS分析結(jié)果是在南京醫(yī)科大學(xué)中心實驗室王富強老師的幫助下完成的，在此表示感謝。

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