楊春華，張毅方，石彥國(guó)，章振東

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱150076； 2.哈高科大豆食品有限責(zé)任公司，哈爾濱150078）

大豆蛋白因其具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及改善質(zhì)構(gòu)的能力，而在食品加工中應(yīng)用廣泛。通常，大豆蛋白由90%的球蛋白質(zhì)組成，主要成分為11S及7S，分別占大豆蛋白的40%及27%。11S是一種分子量大約為35kDa的大豆球蛋白，由6個(gè)亞基組成，其酸性亞基及堿性亞基由二硫鍵連接；7S是由三個(gè)亞基通過(guò)非共價(jià)鍵組成的三聚鏈。7S具有較好的溶解性和乳化性，11S具有較好的凝膠性，但其分散性不好，而分散性的強(qiáng)弱直接影響了大豆蛋白在食品加工中的應(yīng)用。因此，本文試圖對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行改性進(jìn)而提高其分散性。

蛋白質(zhì)改性是人為地對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，從而改善產(chǎn)品的功能性，目前常用的蛋白改性方法主要有化學(xué)法、酶法等等。其中，化學(xué)方法改性的副產(chǎn)物非常復(fù)雜、不易去除且反應(yīng)不易控制。而酶法改性正好彌補(bǔ)了這方面的缺陷。實(shí)踐表明，酶改性是改善大豆蛋白功能特性的一個(gè)有效手段。中性蛋白酶Protex7L是一種從非基因改良的淀粉芽孢桿菌受控發(fā)酵提取的細(xì)菌中性蛋白酶制劑，該酶能夠在中性條件下水解較寬范圍的底物，它特別適合應(yīng)用于不能改變pH的蛋白質(zhì)水解反應(yīng)中。本文以大豆分離蛋白為原料，采用中性蛋白酶Protex 7L對(duì)其進(jìn)行酶解，試圖揭示酶解條件對(duì)大豆蛋白功能特性的影響，探索出一條適合于工業(yè)化生產(chǎn)的專(zhuān)用型大豆分離蛋白加工工藝。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

大豆分離蛋白：黑龍江哈高科大豆食品有限責(zé)任公司；

Protex7L中性蛋白酶：無(wú)錫杰能科試劑公司；

NaOH：分析純，天津市大陸化學(xué)試劑廠。

1.2 主要儀器

DZKW-4電熱恒溫水浴鍋：黃驛市渤海電器廠；

PB-20pH計(jì)：德國(guó)SARTORIUS；

2300 KAU蛋白儀：瑞典FOSS；

分離機(jī)：BECKMEN；

BSZ10S電子天平：德國(guó)SARTORIUS；

HZQ-C空氣振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；

CJJ-781型磁力攪拌器：金壇市望華科教儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大豆蛋白中蛋白質(zhì)含量測(cè)定 凱氏定氮法（GB/T5009.5-2003）。

1.3.2 水解度（DH值）測(cè)定方法 采用pH-stat法。

B：消耗堿量；

N：NaOH摩爾濃度；

α：大豆蛋白氨基的平均解離度，當(dāng)pH值為7時(shí)，α=0.44；

m：水解液中蛋白質(zhì)的總質(zhì)量；

h：每克蛋白質(zhì)底物具有的肽鍵毫摩爾數(shù)，對(duì)于大豆蛋白h=7.75。

1.3.3 分散性評(píng)價(jià) 本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)分散指數(shù)PDI(Protein Disperse Index)作為評(píng)價(jià)大豆分離蛋白分散性的指標(biāo)。

1.3.4 Protex7L酶解大豆蛋白的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 加酶量對(duì)大豆分離蛋白酶解的影響 按底物濃度為12%，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為1h，pH值為7.0，加酶量分別為3.364AU/g SPI、6.728AU/g SPI、13.456AU/g SPI、26.912AU/g SPI、53.824AU/gSPI，以水解度和分散性為指標(biāo)，探討加酶量對(duì)酶解反應(yīng)的影響。

1.3.4.2 底物濃度對(duì)大豆分離蛋白酶解的影響 按加酶量為13.456AU/g SPI，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為1h，pH值為7.0，底物濃度為9%、10%、11%、12%、13%，以水解度和分散性為指標(biāo)，探討底物濃度對(duì)酶解反應(yīng)的影響。

1.3.4.3 反應(yīng)溫度對(duì)大豆分離蛋白酶解的影響 按底物濃度為12%，反應(yīng)時(shí)間為1h，pH值為7.0，加酶量為13.456AU/g SPI，反應(yīng)溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，以水解度和分散性為指標(biāo)，探討反應(yīng)溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響。

1.3.4.4 pH值對(duì)大豆分離蛋白酶解的影響 按底物濃度為12%，反應(yīng)溫度分別50℃，反應(yīng)時(shí)間為1h，加酶量為13.456AU/g SPI，pH值分別為6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4，以水解度和分散性為指標(biāo)，探討pH值對(duì)酶解反應(yīng)的影響。

2 結(jié)果及討論

2.1 加酶量對(duì)大豆蛋白酶解的影響

加酶量對(duì)大豆蛋白酶解程度的影響如圖1所示。

圖1 加酶量對(duì)大豆蛋白酶解程度的影響

從圖1可以看出，大豆蛋白酶解程度與加酶量呈正相關(guān)，但從水解度指標(biāo)來(lái)看，隨著加酶量的增加，水解速率逐漸下降，DH值及PDI值上升速率趨緩。原因有二方面，一方面大豆蛋白的整個(gè)酶解過(guò)程是一個(gè)溶質(zhì)的擴(kuò)散過(guò)程，圖中過(guò)程開(kāi)始時(shí)，曲線較陡，擴(kuò)散速度較快，表明顆粒表面的可溶性蛋白較易擴(kuò)散到溶液中去，隨著反應(yīng)進(jìn)行，顆粒表面的可溶性蛋白消耗殆盡，此時(shí)主要的擴(kuò)散方式是由顆粒內(nèi)部的可溶性蛋白向外擴(kuò)散，其速率遠(yuǎn)小于表面擴(kuò)散速率，反映在曲線上，曲線逐漸趨緩；另一方面，酶解過(guò)程也是一個(gè)水解肽鏈的過(guò)程，剛開(kāi)始酶解過(guò)程，隨著肽鏈不斷水解，不斷暴露出新的氨基，羧基等親水基團(tuán)，因此產(chǎn)物在水中的分散溶解性迅速增加，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶可水解的肽鍵減少，即使增加酶量，酶解速率亦趨緩?？紤]到成本因素及酶解反應(yīng)情況，選用加酶量為13.5AU/gSPI較為適宜。

2.2 底物濃度對(duì)酶解程度的影響

底物濃度對(duì)大豆蛋白酶解的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 底物濃度對(duì)水解度的影響

由圖2可見(jiàn)，隨著底物濃度增加，水解度和分散性逐漸降低。這是由于底物濃度過(guò)高，溶液粘性增加，變成凝膠狀，體系流動(dòng)性較差，不利于蛋白質(zhì)的充分溶解和分散，降低了酶與底物的接觸機(jī)會(huì)；底物濃度不僅影響DH值和PDI值，而且直接決定了大豆蛋白的產(chǎn)量和生產(chǎn)成本，生產(chǎn)中應(yīng)盡量提高底物濃度。綜合考慮，確定底物濃度為10%為適宜的底物濃度。

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響

結(jié)果如圖3所示。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)水解度的影響

由圖3可見(jiàn)，溫度對(duì)水解度的影響非常顯著。當(dāng)溫度從40℃升高到55℃時(shí)，水解度從1.13%陡然增加到1.71%；而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，水解度卻隨之降低。這種影響是因?yàn)闇囟壬呖墒姑复俜磻?yīng)加快，但在較高的溫度時(shí)，酶失活速率也加快。大豆分離蛋白的分散性呈隨溫度先升高后降低的趨勢(shì)，在55℃時(shí)達(dá)到最高。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)溶液通常表現(xiàn)為非牛頓流體性質(zhì)，加熱能加劇蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)，從而加劇蛋白質(zhì)分子的擴(kuò)散。蛋白質(zhì)在溶解時(shí)必需破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用，而加熱可使蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的二硫鍵斷裂，亞基伸展，分散性提高；但另一方面，過(guò)高的反應(yīng)溫度，反應(yīng)速度并沒(méi)有繼續(xù)加快，反而下降。這是因?yàn)槊阜肿游樟诉^(guò)多的能量，引起了維持酶分子結(jié)構(gòu)次級(jí)鍵解體，導(dǎo)致酶蛋白變性，使得酶活力減弱。故確定最佳反應(yīng)溫度為55℃。

2.4 pH值對(duì)大豆蛋白酶解反應(yīng)的影響

結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH值對(duì)水解度的影響

從圖4可見(jiàn)，pH值為7時(shí)水解度已接近最大值，繼續(xù)調(diào)高pH值，對(duì)水解度影響不大，但若超過(guò)一定值，可能引起蛋白酶失活。這是由于酶作為一種特殊的蛋白質(zhì)分子，其催化反應(yīng)的能力與環(huán)境pH值密切相關(guān)，環(huán)境pH值會(huì)影響酶分子的構(gòu)象和酶分子及底物分子的解離狀態(tài)，從而影響酶的活性和酶促反應(yīng)速度，pH值過(guò)高或過(guò)低均對(duì)酶促反應(yīng)不利。認(rèn)為適宜pH值為7.0。

蛋白質(zhì)的分散性與電荷頻率及疏水性有關(guān),高電荷頻率、低疏水性可以有效提高 其分散性。蛋白酶解過(guò)程可以改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并提高電荷頻率，同時(shí)也增加疏水性，但由于電荷頻率的影響遠(yuǎn)大于疏水性的影響，因此總的效果是增加蛋白質(zhì)的溶解性。由圖4可見(jiàn)，當(dāng)pH值為7時(shí)，大豆分離蛋白的分散性最高，偏離7時(shí)，酶活受影響，分散性降低，故最佳pH值為7.0。

3 結(jié)論

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：加酶量、底物濃度、反應(yīng)溫度及體系的pH值等因素在Protex7L酶解大豆蛋白中影響顯著。Protex7L的最適酶解條件為加酶量13.456AU/g、反應(yīng)溫度55℃、底物濃度為10%、pH值為7.0，酶解時(shí)間為1h。在此條件下，水解度為1.57%，蛋白質(zhì)分散指數(shù)為91.8%，可明顯改善大豆蛋白質(zhì)的分散性，從而拓展其在食品加工中的應(yīng)用范圍。

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