陳凡凡 崔磊 曹誼林

組織工程化皮膚，是指有機(jī)體分離出來的表皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞在一種三維生長支架上進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，形成再生的表皮或真皮等同物。組織工程化皮膚作為一種皮膚創(chuàng)傷修復(fù)材料和損傷皮膚的替代品，不僅被覆在創(chuàng)傷表面、保護(hù)創(chuàng)面、促進(jìn)皮膚的恢復(fù)和生長，而且支架材料中的活性細(xì)胞還能通過分泌生長因子促進(jìn)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化，使組織工程化皮膚最終能永久地代替損傷和（或）缺失的皮膚。為了縮短臨床上各種急慢性皮膚缺損患者等待體外構(gòu)建組織工程化皮膚所需的時(shí)間，及時(shí)提供可供移植的替代“皮膚”，必須解決組織工程化皮膚的保存問題，這也直接關(guān)系到其商業(yè)化應(yīng)用的前景。目前，國內(nèi)外均在進(jìn)行組織工程化皮膚的低溫保存和臨床應(yīng)用研究，其關(guān)鍵是保存其中的細(xì)胞活性與功能、細(xì)胞與支架材料特異性粘附及支架材料的生物力學(xué)性能。賀旭等[1]對(duì)復(fù)方殼多糖組織工程化皮膚4℃保存的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),組織工程皮膚凍存7 d后，表皮活力值為未凍存時(shí)的62.46%，真皮活力值為未凍存時(shí)的54.21%。據(jù)報(bào)道，用含10%二甲亞砜、10%胎牛血清的抗凍劑-75℃保存,可保存6個(gè)月[2]。如果在-196℃的環(huán)境下，細(xì)胞、生物組織處于所謂“生命懸持狀態(tài)”，新陳代謝幾乎停止，在理論上幾乎可以無限期儲(chǔ)存[3]。因此，低溫冷凍保存是活體組織長期保存的一種有效方法，有望長期有效地保存組織工程化皮膚產(chǎn)品，建立組織工程化皮膚庫，以隨時(shí)提供臨床移植用的產(chǎn)品。

1 低溫凍存的概述

1.1 冰凍損傷兩因素假說

凍傷是低溫保護(hù)最大的負(fù)反應(yīng)，組織與細(xì)胞凍傷的防治是低溫冷凍保存成功的關(guān)鍵。1972年，Mazur[4]提出冷凍損傷的兩因素假說，認(rèn)為造成冷凍損傷有兩個(gè)獨(dú)立的因素：一是胞內(nèi)冰的形成（Intracellular ice damage），是過快冷卻導(dǎo)致的，冷卻速度越快損傷越大；另一是“溶質(zhì)損傷”（Solute damage），或稱“溶液損傷”（Solution damage），是因冷卻過慢而產(chǎn)生的，是由于細(xì)胞在高濃度的溶液中暴露時(shí)間過長，冷卻速度越慢損傷越大?？炖鋮s是傳熱起主要作用的過程，水分來不及滲出胞外，大量胞內(nèi)冰形成。慢冷卻是質(zhì)量遷移起主要作用的過程，水分由胞內(nèi)大量滲出，細(xì)胞劇烈收縮，但無胞內(nèi)冰產(chǎn)生。由于此兩因素的綜合作用，理論上就必然存在某一最佳冷卻速率，并對(duì)應(yīng)于低溫保存的最佳存活率。

1.2 冷凍保護(hù)劑（Cryoprotective agent，CPA）

在不加冷凍保護(hù)劑而直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pH值改變、蛋白變性等，引起細(xì)胞死亡。所以，細(xì)胞和生物體的低溫保存離不開冷凍保護(hù)劑。冷凍保護(hù)劑又稱抗凍劑，合理地選擇冷凍保護(hù)劑對(duì)低溫保存至關(guān)重要。冷凍保護(hù)劑應(yīng)具有以下特點(diǎn)：易溶于水，對(duì)細(xì)胞無毒，易從組織細(xì)胞中清除。其作用主要表現(xiàn)在增加膜通透性，加速細(xì)胞內(nèi)的水分流到細(xì)胞外結(jié)冰，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，降低冰點(diǎn)，提高溶液的粘滯性，阻止冰晶生長。

冷凍保護(hù)劑大致分為兩類。一為滲透性冷凍保護(hù)劑，多屬低分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液的黏性增加，從而弱化水的結(jié)晶過程，達(dá)到保護(hù)目的。常用的滲透型冷凍保護(hù)劑有甘油、二甲亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（PG）等。但滲透型冷凍保護(hù)劑使用濃度、滲入細(xì)胞的能力、對(duì)水分子活性的影響等各不相同，如甘油適宜于慢速冷卻，而DMSO卻易于滲入細(xì)胞，并在常溫下稍有毒性。二是非滲透型冷凍保護(hù)劑，能溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，它使溶液呈過冷狀態(tài)，可在特定溫度下降低溶質(zhì)（電解質(zhì)）濃度，從而起到保護(hù)作用。非滲透型冷凍保護(hù)劑主要有聚乙烯吡咯烷酮（Polyvingyl pyrollidone，PVP）、蔗糖（Sucrose）、葡聚糖（右旋糖酐，Dextrane）、聚乙二醇（Polyethylene glycol， PEG）、白蛋白（Albumin）、羥乙基淀粉（Hydroxethyl starch， HES）等。此類冷凍保護(hù)劑對(duì)快速、慢速冷卻均有保護(hù)效果。

冷凍保護(hù)劑雖有保護(hù)作用，但也有一定的毒性。其毒性作用機(jī)制可能是：①通過細(xì)胞膜引起的滲透性損傷（物理性損傷）；②與蛋白質(zhì)和（或）脂膜結(jié)合，使之變性（化學(xué)性損傷）。這些損傷與溫度、防凍劑的含量有關(guān)。一般是溫度越低時(shí)，冷凍保護(hù)劑毒性越小；冷凍保護(hù)劑含量越高，毒性越大。因此，保護(hù)劑的種類、濃度及加入、清除的方式對(duì)細(xì)胞的存活都有一定的影響。

2 組織工程皮膚的低溫保存

組織工程產(chǎn)品深低溫保存中使用冷凍保護(hù)劑的目的是通過替換細(xì)胞和組織內(nèi)的水分，將降溫-凍存-復(fù)溫循環(huán)中冰晶形成引起的損害減到最小，并促進(jìn)細(xì)胞非結(jié)晶態(tài)的生成。組織工程化皮膚根據(jù)解剖和發(fā)揮的主要替代作用可以分為表皮替代物、真皮替代物和復(fù)合皮膚替代物。目前的低溫保存研究的熱點(diǎn)，主要集中在真皮替代物和復(fù)合皮膚替代物的保存。

2.1 真皮替代物的低溫保存

Teasdale等[5]研究了低溫保護(hù)劑種類以及降溫速率對(duì)以膠原凝膠為支架的組織工程化真皮活性的影響，結(jié)果表明，以DMSO為低溫保護(hù)劑，以較低的速率降溫可取得較好的保存效果。Applegate等[6]就組織工程化真皮低溫保存過程中存在的問題進(jìn)行了綜述，指出細(xì)胞損傷是影響真皮替代物低溫保存效果的主要因素之一，且體外培養(yǎng)的細(xì)胞更易于形成胞內(nèi)冰，而支架材料、細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)熱膨脹系數(shù)的差異可能會(huì)形成導(dǎo)致組織及細(xì)胞損傷的熱彈性應(yīng)力。王欣等[7－8]對(duì)以聚羥基乙酸（PGA）纖維（編織）為支架的組織工程化真皮，用DMSO為低溫保護(hù)劑進(jìn)行了程序降溫的低溫保存實(shí)驗(yàn)，探討低溫保護(hù)劑的濃度、降溫速率等對(duì)組織工程化真皮低溫保存效果的影響。實(shí)驗(yàn)顯示，培養(yǎng)14 d的組織工程化真皮置于10%DMSO溶液中，以1℃／min速率降溫至-196℃可獲得75%的細(xì)胞存活率，可滿足臨床應(yīng)用的要求。

2.2 復(fù)層組織工程化皮膚的低溫保存

Harriger等[9]采用培養(yǎng)的人角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞制成的組織工程皮膚，以10%DMSO為防凍劑，進(jìn)行20℃/min的程序性降溫，至-196℃保存，然后置于37℃水浴中快速復(fù)溫，發(fā)現(xiàn)組織工程化皮膚活力欠佳，認(rèn)為可能與防凍劑的含量有關(guān)。Kentaro等[10]將成纖維細(xì)胞擴(kuò)增后種植于皮膚支架上，支架由單層的海綿狀透明質(zhì)酸和膠原構(gòu)成，凍存保護(hù)劑為DMEM+10%DMSO+40%胎牛血清。結(jié)果顯示，在-152℃保存3周,復(fù)蘇后最高的即刻細(xì)胞存活率為56.2%，經(jīng)過37℃水浴快速復(fù)蘇并再培養(yǎng)1周后，細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增到凍存前的200%。后續(xù)研究顯示，在-152℃保存1年后，細(xì)胞存活率為52%；保存2年將降至29.5%；經(jīng)-80℃保存6個(gè)月，或-152℃保存1年，都能保持足夠的細(xì)胞活力和增殖活性，并表達(dá)足夠的成纖維細(xì)胞生長因子[11]。魯元?jiǎng)偟萚12]研究了復(fù)方殼多糖人工皮膚的凍存，他們將培養(yǎng)1周的人工皮膚置于含90%基礎(chǔ)培養(yǎng)基 ＋10%DMSO的凍存液中，按4℃30min、0℃過夜、-20 ℃ 2～3 h、液氮?dú)庀?6～8 h、液氮液相的凍存，復(fù)蘇后培養(yǎng)1 h，可見真皮基質(zhì)內(nèi)的成纖維細(xì)胞又伸出突起，開始生長，但在細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)有較大的孔隙，且大小不均勻；繼續(xù)培養(yǎng)1周后，胞外基質(zhì)孔隙基本消失，表皮可大致區(qū)分為基底層、棘層和角質(zhì)層，各層均有層數(shù)不等的扁平梭形細(xì)胞，外周的表皮細(xì)胞結(jié)合不甚牢固，易脫離。人工皮膚的真皮部分，可見呈梭形結(jié)構(gòu)的成纖維細(xì)胞大致平行排列，分布有序。所有復(fù)蘇的標(biāo)本都恢復(fù)了正常的代謝活動(dòng)，角質(zhì)形成細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的生長特性與未進(jìn)行凍存的人工皮膚基本相同。

2.3 玻璃化低溫保存方法

從目前的研究成果看，傳統(tǒng)的低溫保存技術(shù)對(duì)僅含成纖維細(xì)胞的真皮替代物保存效果較佳，能滿足臨床應(yīng)用的要求，而對(duì)雙層組織工程化皮膚的保存效果并不理想，因其對(duì)表皮細(xì)胞的損害較大。因此，玻璃化保存可能是組織工程化皮膚產(chǎn)品更理想的保存方法。玻璃化（Vitrification）是指液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)（玻璃態(tài)）的固化過程。溶液在冷凍過程中黏稠度增高，相變后轉(zhuǎn)變成固態(tài)時(shí)，不形成或只形成對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)無損傷的極小冰晶，高黏性使分子的彌散受到極度抑制，液體固化為玻璃態(tài)，從而避免冰晶形成過程中對(duì)細(xì)胞的損傷。使溶液玻璃化有兩條途徑：一是大幅度提高冷卻速率；二是增加溶液濃度。玻璃化低溫保存方法，是將生物組織或細(xì)胞經(jīng)極高濃度的玻璃化溶液快速脫水后，直接投入液氮，使生物材料連同玻璃化溶液發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變，進(jìn)入玻璃態(tài)。保存終止后，復(fù)溫要快速化凍，防止去玻璃化的發(fā)生。生物組織或細(xì)胞能安全渡過冷卻和化凍兩個(gè)關(guān)口，就可保證凍存的成功。但是，高濃度的冷凍保護(hù)劑對(duì)生物組織或細(xì)胞具有潛在的毒性反應(yīng)，而且這種毒性反應(yīng)與冷凍保護(hù)劑濃度和溫度密切相關(guān)。因此，用玻璃化法凍存組織細(xì)胞[13－15]的關(guān)鍵是在可形成玻璃化狀態(tài)的前提下，盡可能選擇較低的冷凍保護(hù)劑濃度，以減小冷凍保護(hù)劑的毒性反應(yīng)，并仔細(xì)控制好整個(gè)玻璃化保存過程的操作環(huán)節(jié)，達(dá)到保存組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的目的。玻璃化保存液已可成功保存如胰腺[16]、組織工程化骨[17]、干細(xì)胞[18]、皮膚和表皮細(xì)胞[19－22]、血管[23]、氣管[24]等。 Pasch 等[19]把角質(zhì)細(xì)胞種植于小培養(yǎng)皿形成細(xì)胞單層，比較了100 g/L丙三醇、100 g/L乙二醇、100 g/L DMSO和10%的羥乙基淀粉（HES）對(duì)單層角質(zhì)細(xì)胞的保存效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)溫后細(xì)胞層在光鏡下完整無裂隙，HES以3℃/min速率降溫得到了28.5%的細(xì)胞回收率，明顯優(yōu)于1℃/min的降溫速率，也優(yōu)于DMSO等其他3種保存劑。其后續(xù)研究提示，單層細(xì)胞凍存的回收率要高于懸浮細(xì)胞凍存組[20]。程啟康等[21]用包含5.4 mol/L乙二醇和1.4 mol/L DMSO的玻璃化液凍存成纖維細(xì)胞獲得了87.1%的細(xì)胞存活率。組織工程化皮膚產(chǎn)品的玻璃化溶液配方、達(dá)到玻璃化的深低溫過程、損傷機(jī)制、復(fù)溫條件等研究尚處于起步階段，還需深入研究，其有效性亟待驗(yàn)證。

2.4 海藻糖在玻璃化凍存中應(yīng)用

玻璃化法縮短了冷凍處理的時(shí)間，簡化了步驟，不需要昂貴的設(shè)備，不要求嚴(yán)格的降溫速率，但最不利的因素就是高含量的防凍劑的毒性作用。所以，降低玻璃化保存液中透入性抗凍劑的含量，或完全由糖類、聚合物替代，以降低其毒性和解凍時(shí)對(duì)細(xì)胞的滲透性破壞是目前的主要研究方向。在非滲透性保護(hù)劑中，海藻糖是目前研究的熱點(diǎn)。它是由2個(gè)葡萄糖分子以α,α,1,1,-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，自身性質(zhì)非常穩(wěn)定，能夠在高溫、高寒、干燥失水等惡劣的條件下，在細(xì)胞表面形成特殊的保護(hù)膜，有效保護(hù)生物分子結(jié)構(gòu)不被破壞。它的抗凍機(jī)制[25－29]是多方面的：①在冷凍之前使細(xì)胞脫水，減少細(xì)胞內(nèi)的含水量，并在生物分子表面依靠帶電荷的水合基團(tuán)間的氫鍵形成保護(hù)膜，代替了維護(hù)三級(jí)結(jié)構(gòu)所必需的水分子，從而使組織在極低水分時(shí)仍保持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能的完整性，避免細(xì)胞內(nèi)成分的損失；②有助于避免滲透性保護(hù)劑滲入細(xì)胞所導(dǎo)致的過度膨脹和滲透性休克；③能代替脂質(zhì)分子頭部基團(tuán)間的水分子，降低膜的相變溫度，防止重新水化時(shí)脂質(zhì)狀態(tài)的轉(zhuǎn)換及伴隨出現(xiàn)的裂縫；④能非特異性地穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)生物膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)；⑤具有極佳的玻璃化特性，其玻璃化溫度接近-30℃，比傳統(tǒng)滲透性保護(hù)劑的玻璃化溫度（<-65℃）要高得多。海藻糖已被應(yīng)用于胚胎干細(xì)胞[30]、精子[31]、紅細(xì)胞[32]、皮膚[33]等。 Erdag 等[33-34]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用海藻糖/DMSO作為保護(hù)劑，能提高凍存的胎兒皮膚的活力。將該方法所凍存的皮膚移植到免疫缺陷大鼠后，移植面與新鮮未冷凍皮膚移植組無明顯差別，并且顯著的優(yōu)于傳統(tǒng)保護(hù)劑組。

3 展望

目前，組織工程化皮膚僅限于個(gè)性化、小規(guī)模的應(yīng)用，停留在臨床研究和實(shí)驗(yàn)室水平。要真正形成產(chǎn)業(yè)，必須解決組織工程化皮膚的保存問題，建立標(biāo)準(zhǔn)化的保存方法。因此，凍存技術(shù)將在組織工程化皮膚的研究與開發(fā)應(yīng)用中發(fā)揮重要作用，相信隨著組織工程化皮膚玻璃化凍存研究的不斷深入，組織工程化皮膚的產(chǎn)業(yè)化、商品化將獲得實(shí)現(xiàn)，成為臨床治療皮膚損傷和缺損的首選方法。

[1]賀旭,伍津津,楊桂紅.復(fù)方殼多糖組織工程皮膚活力測(cè)定的研究[J].重慶醫(yī)學(xué),2008,37:914-917.

[2]Bowering KC.The use of Dermagraft in the treatment of diabetic foot ulcers[J].Today's Therapeutic Trends,1998,16:87-96.

[3]Isachenko V,Soler C.Vitrificaiton of immature pocine oocytes:effects of lipid droplets,tempe-rature,cytoskeleton，and addition and removal of croprotectant[J].Cryobiology,1998,36:250-253.

[4]Mazur PL.A two factor hypothesis of freezing injury-evidence from Chinese hamster tissue cells[J].Exp Cell Res,1972,71:345-355.

[5]Teasdale B,Sieber VK,Riches DJ,et al.Cryopreservation of cultured dermal fibroblast impregnated collagen gels[J].Burns,1993,19:406-410.

[6]Applegate DR,Liu K,Mansbridge J.Practical considerations for large-scale cryopreservation of a tissue engineered human dermal replacement[J].Advances in Heat and Mass Transfer in Biotechnology,1999,44:71-91.

[7]王欣,華澤釗,楊光輝,等.培養(yǎng)9天的組織工程化真皮低溫保存的研究[J].低溫工程,2003,131:17-22.

[8]Wang X,Hua TC,Sun DW,et al.Cryopreservation of tissue-engineered dermal replacement in Me2SO:Toxicity study and effects of concentration and cooling rates on cell viability[J].Cryobiology,2007,55:60-65.

[9]Harriger MD,Supp AP,Swope VB,et al.Reduced engraftment and wound closure of cryopreserved cultured skin substitutes grafted to athymic mice[J].Cryobiology,1997,35:132-142.

[10]Kentaro K,Yoshimitsu K.Development of a cultured dermal substitute composed of a spongy matrix of hyaluronic acid and atelo-collagen combined with fibroblasts:cryopreservation[J].Artificial Organs,2004,28:182-188.

[11]Kentaro K,Yoshimitsu K.The possibility of long-term cryopreservation of cultured dermal substitute[J].Artificial Organs,2005,29:800-805.

[12]魯元?jiǎng)?伍津津,趙莉蓉,等.復(fù)方殼多糖人工皮膚的凍存研究[J].中國臨床康復(fù),2004,8:2680-2681.

[13]Kuleshova LL,Lopata A.Vitrification can be more favorable than slow cooling[J].Fertil Steril,2002,78:449-454.

[14]Kuleshova LL,Gouk SS,Hutmacher DW.Vitrification as a prospect for cryopreservation of tissue-engineered cinstructs[J].Biomaterials,2007,28:1585-1596.

[15]Gregory MF,Brian W,Jun W,et al.Cryopreservation of organs by vitrification:perspectives and recent advances[J].Cryobiology,2004,48:157-178.

[16]Taylor MJ,Baicu S.Review of vitreous islet cryopreservation:some practical issues and their resolution[J].Organogenesis,2009,5:155-166.

[17]Yin H,Cui L,Liu G,et al.Vitreous cryopreservation of tissue engineeredbonecomposedofbonemarrowmesenchymalstemcellsand partially demineralized bone matrix[J].Crybiology,2009,59:180-187.

[18]Wen F,Magalhaes R.Vitreous cryopreservation of nanofibrous tissue-engineered constructs generated using mesenchymal stromal cells[J].Tissue Eng Part C Methods,2009,15:105-114.

[19]Pasch J,Schiefer A,Heschel I,et al.Cryopreservation of keratinocytes in a monolayer[J].Cryobiology,1999,39:158-168.

[20]Pasch J,Schiefer A,Heschel I,et al.Variation of the HES concentration for the cryopreservation of keratinocytes in suspensions and in monolayers[J].Cryobiology,2000,41:89-96.

[21]程啟康,王欣,楊鵬飛,等.成纖維細(xì)胞玻璃化保存的初步實(shí)驗(yàn)研究[J].低溫工程,2004,138:23-26.

[22]Naoto Y,Eiju U.Comparative evaluation of re-epithelialization promoted by fresh or cryopreserved cultured dermal substitute[J].J Artif Organs,2008,1:221-224.

[23]Baicu S,Taylor MJ.Cryopreservation of carotid artery segments via vitrification subject to marginal thermal conditions:correlation of freezing visualization with functional recovery[J].Cryobiology,2008,57:1-8.

[24]Xu H,Shi HC.An experimental research on cryopreserving rabbit trachea by vitrification[J].Cryobiology,2009,58:225-231.

[25]Alan DE,Pan YT.New insights on trehalose:a multifunctional molecule[J].Glycobiology,2003,13:17-27.

[26]Jain N,Roy I.Effect of trehalose on protein structure[J].Protein Sci,2009,18:24-36.

[27]Jain N,Roy I.Trehalose and protein stability[J].Curr Protoc Protein Sci,2010,4:4-9.

[28]Deb K.A sweet potion to put embryonic stem cells to sleep[J].ScientificWorld J,2009,31:236-249.

[29]伍津津,朱堂友.皮膚組織工程學(xué)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2009.

[30]Wu CF,Hsiao Chien Tsung,Zhang WJ,et al.Improved cryopreservation of human embryonic stem cells with trehalose[J].Reproductive BioMedicine,2005,11:733-739.

[31]Abdelmoneim Y,David C.Application of intra-and extracellular sugars and dimethylsulfoxide to human oocyte cryopreservation[J].J Assist Reprod Genet,2009,26:341-345.

[32]Han Y,Quan GB,Liu XZ,et al.Improved preservation of human red blood cells by lyophilization[J].Cryobiology,2005,51(2):152-164.

[33]Erdag G,Eroglu A,Morgan J,et al.Cryopreservation of fetal skin is improved by extracellular trehalose[J].Cryobiology,2002,44:218-228.

[34]Erdag G,Morqan JR.Survival of fetal skin grafts is prolonged on the human peripheral blood lymphocyte reconstituted-severe combined immunodeficient mouse/skin allograft model[J].Transplantation,2002,73:519-528.