張國(guó)明,王禹,李天德,張大為,劉秀華,李玉珍

乳酸對(duì)大鼠急性心肌缺血再灌注損傷后適應(yīng)的心肌保護(hù)作用＊

張國(guó)明,王禹,李天德,張大為,劉秀華,李玉珍＊

目的：在大鼠急性心肌缺血再灌注中,探討乳酸延長(zhǎng)局部組織酸中毒能否模擬后適應(yīng)發(fā)揮有效的心肌保護(hù)作用。

方法：72只 SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、再灌注損傷組、后適應(yīng)組和乳酸組,每組 18只。測(cè)定再灌注 10min后右心房血漿pH值,并在不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,分別測(cè)定心肌酶活力、心肌丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、心肌組織線粒體吸光度,磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶、線粒體調(diào)控因子Bcl-2和 Bax的表達(dá),以及細(xì)胞凋亡和心肌梗死面積。

結(jié)果：再灌注 10min后乳酸組與后適應(yīng)組右心房血漿pH值相似(P＞0.05)。再灌注 1h后乳酸組和后適應(yīng)組同再灌注損傷組相比均顯著抑制了線粒體吸光度的降低(P＜0.05),但再灌注 6 h后乳酸組抑制作用明顯減弱(P＞0.05)。乳酸組和再灌注損傷組相比未改變心肌組織丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性(P＞0.05)。磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶、Bcl-2和Bax的表達(dá)上乳酸組雖優(yōu)于再灌注損傷組(P＜0.05),但同后適應(yīng)組相比差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。另乳酸組可不同程度降低心肌酶活力、凋亡指數(shù)和心肌梗死面積,但凋亡指數(shù)仍顯著高于后適應(yīng)組(P＜0.05)。

結(jié)論：乳酸可以部分模擬后適應(yīng)帶來(lái)的保護(hù)效應(yīng),局部酸中毒的短暫延長(zhǎng)可能只是后適應(yīng)最上游觸發(fā)因子之一。關(guān)鍵詞 后適應(yīng);再灌注損傷;乳酸;酸中毒;線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔

(Chinese Circulation Journal,2010,25：34.)

迅速有效再灌注治療是應(yīng)對(duì)急性心肌缺血的最佳方法,但可帶來(lái)再灌注損傷。2003年 Zhao等[1]提出了缺血后適應(yīng)的概念,多項(xiàng)研究證實(shí)后適應(yīng)可有效減輕再灌注損傷[2-4],研究認(rèn)為后適應(yīng)的保護(hù)機(jī)制最后都?xì)w于線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的抑制[5,6]。Cohen等[7]提出了后適應(yīng)觸發(fā)因子的酸中毒假說(shuō),認(rèn)為碳酸緩沖液可模擬后適應(yīng)的保護(hù)作用。本研究在活體大鼠心肌梗死再灌注模型中,使用乳酸延長(zhǎng)局部組織酸中毒模擬后適應(yīng),以進(jìn)一步探討后適應(yīng)保護(hù)機(jī)制的上游觸發(fā)因子。

1 材料與方法

材料：健康雄性 SPF級(jí) SD大鼠 72只,于 2008-07至 2008-11購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體重200～250 g。乳酸購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司,微量丙二醛和超氧化物歧化酶試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司,心肌組織線粒體提取試劑盒和通透性轉(zhuǎn)換孔比色法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。兔抗小鼠磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶、線粒體調(diào)控因子Bcl-2和 Bax多克隆抗體購(gòu)自美國(guó) SantaCruz公司,凋亡試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

模型制作：按趙秀梅等[8]的球囊墊扎法復(fù)制大鼠在體心肌梗死再灌注模型。以 2%戊巴比妥鈉(0.23ml/100 g)腹腔注射麻醉,呼吸機(jī)輔助呼吸,開(kāi)胸后在左心耳下緣與肺動(dòng)脈圓錐間用縫合線穿過(guò)前降支深部,將充盈的后擴(kuò)張球囊[Acrostak公司,瑞士,壓力調(diào)為 1大氣壓(ATM)]墊于血管與結(jié)扎線之間,結(jié)扎后將壓力調(diào)節(jié)為 12 ATM。缺血 45分鐘后將壓力迅速調(diào)為 0 ATM,根據(jù)分組給予不同處理。術(shù)后 24小時(shí)(每組 6只),以20%烏拉坦(0.8ml/100 g)腹腔注射麻醉,經(jīng)右頸總動(dòng)脈插管入左心室,監(jiān)測(cè)主動(dòng)脈及左心室壓力,而后經(jīng)頸動(dòng)脈插管取血 3～4m l,處死取心臟(另術(shù)后 1小時(shí)和術(shù)后 6小時(shí)每組各取6只大鼠,麻醉后直接處死取心臟)。

實(shí)驗(yàn)分組：隨機(jī)分為 4組(每組 18只)：假手術(shù)組：分離左冠狀動(dòng)脈并穿線,但不結(jié)扎,曠置 45min后微量注射器(100μl)注射生理鹽水 60μl;再灌注損傷組：缺血 45min后將壓力調(diào)至 0 ATM,移除球囊后立即微量注射器在缺血部位分三點(diǎn)注射生理鹽水共計(jì)60μl,而后持續(xù)再灌注;后適應(yīng)組：缺血 45 min后、再灌注前通過(guò)球囊放氣—充盈實(shí)現(xiàn)再灌注和缺血反復(fù) 4輪,其時(shí)間為 20/20 s×4,移除球囊后立即微量注射器在缺血部位分三點(diǎn)注射生理鹽水共計(jì) 60μl,而后持續(xù)再灌注;乳酸組：缺血 45min移除球囊后,立即使用微量注射器在缺血部位分三點(diǎn)注射乳酸共計(jì) 60μl,而后持續(xù)再灌注。

缺血心肌丙二醛和超氧化物歧化酶活性測(cè)定：使用術(shù)后 1 h處死大鼠,檢測(cè)方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。缺血心肌線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔測(cè)定：使用術(shù)后 1 h和6 h處死大鼠,取出心臟后迅速冷凍,2周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。首先差速離心法提取線粒體(低溫離心機(jī) 1000 g 10分鐘,取上清低溫高速離心機(jī) 10000 g 15分鐘,沉淀物為線粒體),詹納斯綠 B對(duì)線粒體進(jìn)行鑒定;蛋白定量后取線粒體(每組含蛋白 200μg)按試劑盒說(shuō)明書(shū)稀釋、誘導(dǎo),使用酶標(biāo)儀在 520 nm測(cè)定線粒體吸光度,取0min、1min、5min、15min、30 min五個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)。蛋白免疫印跡分析：使用術(shù)后 6 h處死大鼠,取出心臟迅速冷凍,2月內(nèi)進(jìn)行檢測(cè),勻漿后行聚丙烯酰胺凝膠電泳,經(jīng)轉(zhuǎn)膜、兩次免疫反應(yīng),抗原抗體復(fù)合物用化學(xué)發(fā)光法顯示,以 Image-Pro Plus圖像分析軟件分析蛋白條帶的積分光密度值(平均光密度值 ×面積)。心肌酶活力測(cè)定：經(jīng)動(dòng)脈插管抽取動(dòng)脈血后,3000 rpm離心 15min后取上清,冷凍保存,而后以全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)測(cè)定肌酸激酶和肌酸激酶同工酶活性。凋亡檢測(cè)：使用術(shù)后 24 h處死大鼠,取心臟中性甲醛固定 24 h(10%,pH=7.4),按試劑盒說(shuō)明行心肌組織切片細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)。每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野,計(jì)算出平均每 100個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù),以百分?jǐn)?shù)表示凋亡指數(shù)。心肌梗死面積測(cè)定：再灌注 24 h經(jīng)頸動(dòng)脈取血后,將頸動(dòng)脈插管回抽至主動(dòng)脈,開(kāi)胸將原結(jié)扎絲線再次結(jié)扎,經(jīng)頸動(dòng)脈插管緩慢注入 1%伊文氏藍(lán) 3～5m l。染色冷凍后按垂直于左心室長(zhǎng)軸方向切片,置入 2%三苯基氯化四氮唑孵育20 min。掃描后采用 Image-Pro Plus圖像分析軟件分別計(jì)算各部分的面積。缺血心肌用缺血心肌面積與左心室面積之比表示,梗死范圍以梗死心肌面積與缺血心肌面積之比表示。

2 結(jié)果

血流動(dòng)力學(xué)：再灌注 24 h后 3組間心率和平均動(dòng)脈壓未見(jiàn)明顯差異,后適應(yīng)組和乳酸組與再灌注損傷組比較壓力最大上升速度和壓力最大下降速度明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);乳酸組與后適應(yīng)組相比壓力最大上升速度顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 (表 1)

表 1 3組再灌注 24 h后的血流動(dòng)力學(xué)比較(n=6,±s)

表 1 3組再灌注 24 h后的血流動(dòng)力學(xué)比較(n=6,±s)

注：與再灌注損傷組比＊P＜0.05;與后適應(yīng)組比△P＜0.05;1mmHg=0.133 kPa。

組別 心率(次/分) 平均動(dòng)脈壓(mmHg)壓力最大上升速度(mmHg/s)壓力最大下降速度(mmHg/s)再灌注損傷組 351.00±36.18 98.17±10.23 604.83±60.72 441.00±37.79后適應(yīng)組 376.50±45.33 105.33±5.39 781.67±59.72＊ 546.67±57.79＊乳酸組 357.33±33.67 99.83±5.31 686.67±61.09＊△ 522.17±44.41＊

右心房血漿 pH值、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性及心肌酶比較：再灌注 10 min后右心房血漿 pH值、肌酸激酶及肌酸激酮同工酶乳酸組和后適應(yīng)組之間沒(méi)有明顯差異,但這兩組均較再灌注損傷組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。丙二醛含量后適應(yīng)組低于再灌注損傷組,超氧化物歧化酶活性后適應(yīng)組高于再灌注損傷組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而乳酸組這兩項(xiàng)指標(biāo)雖較再灌注損傷組好轉(zhuǎn),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),乳酸組同后適應(yīng)組之間這兩項(xiàng)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(表 2)

表 2 3組再灌注 10m in后右心房血漿pH值、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性及心肌酶比較(±s)

表 2 3組再灌注 10m in后右心房血漿pH值、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性及心肌酶比較(±s)

注：與再灌注損傷組比＊P＜0.05;與后適應(yīng)組比△P＜0.05

組別 右心房血漿 pH值(n=18)丙二醛含量(nmol/mgpro,n=6)超氧化物歧化酶活性(U/mgpro,n=6)肌酸激酶(U/L,n=6)肌酸激酶同工酶(U/L,n=6)再灌注損傷組 7.43±0.03 1.54±0.28 35.48±12.48 1249.50±211.51 966.84±263.80后適應(yīng)組 7.33±0.03＊ 1.12±0.37＊ 58.58±13.28＊ 582.50±263.15＊ 486.13±150.91＊乳酸組 7.32±0.07＊ 1.50±0.27△ 44.95±18.01△ 882.00±254.72＊ 690.03±329.64＊

缺血心肌組織線粒體吸光度：再灌注 1 h后連續(xù)30min乳酸組和后適應(yīng)組線粒體吸光度無(wú)明顯差異(P＞0.05);但兩組均高于再灌注損傷組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。再灌注 6 h后連續(xù) 30min,乳酸組和后適應(yīng)組線粒體吸光度均高于再灌注損傷組(乳酸組 15min和 30 min除外),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);乳酸組線粒體吸光度再灌注 6 h后連續(xù) 30min均顯著低于后適應(yīng)組(P＜0.05)。(表 3、4)

表 3 3組再灌注 1 h后線粒體吸光度比較(n=6,±s)

表 3 3組再灌注 1 h后線粒體吸光度比較(n=6,±s)

注：與再灌注損傷組比＊P＜0.05

組別 0min 1m in 5m in 15min 30m in再灌注損傷組 0.306±0.005 0.304±0.010 0.302±0.010 0.298±0.027 0.293±0.015后適應(yīng)組 0.355±0.006＊ 0.360±0.011＊ 0.358±0.013＊ 0.353±0.023＊ 0.348±0.026＊乳酸組 0.351±0.006＊ 0.350±0.008＊ 0.348±0.010＊ 0.342±0.020＊ 0.338±0.020＊

表 4 3組再灌注 6 h后線粒體吸光度比較(n=6,±s)

表 4 3組再灌注 6 h后線粒體吸光度比較(n=6,±s)

注：與再灌注損傷組比＊P＜0.05;與后適應(yīng)組比△P＜0.05

組別 0min 1m in 5m in 15 min 30m in再灌注損傷組 0.316±0.005 0.314±0.012 0.312±0.018 0.308±0.022 0.303±0.017后適應(yīng)組 0.375±0.005＊ 0.372±0.016＊ 0.369±0.016＊ 0.363±0.028＊ 0.359±0.021＊乳酸組 0.341±0.006＊△ 0.338±0.006＊△ 0.334±0.018＊△ 0.329±0.020△ 0.320±0.017△

蛋白免疫印跡檢測(cè)磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶、Bcl-2和 Bax的表達(dá)(表 5)：乳酸組和后適應(yīng)組磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶和 Bcl-2表達(dá)較再灌注損傷組明顯升高(P＜0.01),乳酸組顯著低于后適應(yīng)組 (P＜0.05)。Bax呈現(xiàn)相反變化,乳酸組和后適應(yīng)組較再灌注損傷組明顯降低,乳酸組顯著高于后適應(yīng)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表 5 3組蛋白免疫印跡結(jié)果比較(n=6,±s)

表 5 3組蛋白免疫印跡結(jié)果比較(n=6,±s)

注：與再灌注損傷組比＊P＜0.05;與后適應(yīng)組比△P＜0.05

組別 磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶 Bcl-2 Bax再灌注損傷組 0.28±0.05 0.02±0.01 2.40±0.45后適應(yīng)組 2.77±0.79＊ 1.21±0.35＊ 0.37±0.11＊乳酸組 1.50±0.23＊△ 0.22±0.03＊△ 1.01±0.16＊△

心肌細(xì)胞凋亡：假手術(shù)組很少見(jiàn)到染色陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞。再灌注損傷組凋亡細(xì)胞明顯多于乳酸組(15.00±1.90 vs 12.83±2.48,P＜0.05)和后適應(yīng)組(15.00±1.90 vs 9.83±2.04,P＜0.05);乳酸組凋亡指數(shù)(12.83±2.48)%顯著高于后適應(yīng)組 (9.83±2.04)%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

心肌梗死面積：后適應(yīng)組心肌梗死面積(27.97±10.89)%較再灌注損傷組(45.66±10.81)%降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);乳酸組(38.84±7.50)%低于再灌注損傷組,高于后適應(yīng)組,但差異均未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

自 2003年 Zhao等提出缺血后適應(yīng)的概念后,多種屬研究均證實(shí)后適應(yīng)可有效減輕再灌注損傷,但其保護(hù)機(jī)制的研究目前多集中在胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)上,對(duì)最上游的觸發(fā)因子研究較少。新近 Cohen等[7,9]提出了后適應(yīng)的酸中毒假說(shuō),認(rèn)為后適應(yīng)的保護(hù)作用緣于短暫缺血延長(zhǎng)了局部組織的酸中毒,從而抑制了線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放。繼而多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)使用酸性灌注液[10-11]可以通過(guò)延長(zhǎng)酸中毒發(fā)揮類(lèi)似后適應(yīng)的保護(hù)作用。因?yàn)槿毖陆M織酸中毒為代謝性酸中毒,主要成分是乳酸,后適應(yīng)短暫延長(zhǎng)酸中毒即來(lái)自于乳酸沖散速度的減慢,所以使用乳酸模擬后適應(yīng)延長(zhǎng)酸中毒理論上更接近真實(shí)的生理變化過(guò)程。本研究在缺血心肌局部注射乳酸,可有效模擬局部組織的酸中毒,術(shù)后 10min右心房血漿 pH值結(jié)果顯示乳酸組同后適應(yīng)組相似,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)方法較為成功的模擬了后適應(yīng)延長(zhǎng)的局部組織酸中毒。

目前認(rèn)為線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放會(huì)引發(fā)線粒體腫脹,繼而膜間隙前凋亡因子釋放至胞漿導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)顯示乳酸組在再灌注 1 h內(nèi)可以發(fā)揮較好的抑制作用,但再灌注 6 h后抑制作用較后適應(yīng)組明顯減弱,到第 15min和 30min時(shí)乳酸組的保護(hù)效應(yīng)幾乎消失。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶是后適應(yīng)的重要保護(hù)途徑;Bcl-2和 Bax是重要的線粒體調(diào)控因子,前者可抑制通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放,而后者作用與其相反。本研究發(fā)現(xiàn)乳酸組磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶、Bcl-2/Bax較再灌注損傷組明顯升高,但顯著低于后適應(yīng)組。這說(shuō)明在此條途徑的激活上乳酸只是部分模擬了后適應(yīng),這與上述通透性轉(zhuǎn)換孔的變化相一致。

酸中毒假說(shuō)認(rèn)為后適應(yīng)的保護(hù)效應(yīng)緣于線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的兩次抑制,第二次抑制需要氧自由基作為中間分子才能正常傳導(dǎo)。本研究結(jié)果也支持上述推論,乳酸組能抑制早期的通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放,但未能抑制后期轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放。這可能緣于乳酸未顯著降低氧自由基的生成(丙二醛和超氧化物歧化酶可以部分反映氧自由基的含量),而后者既起到了信號(hào)傳導(dǎo)的作用,又因濃度過(guò)高損傷了心肌組織,故保護(hù)效果未能完全模擬。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)局部注射乳酸能較好模擬后適應(yīng)帶來(lái)的酸中毒延長(zhǎng),可部分模擬其保護(hù)效果。但要完全探明后適應(yīng)的最上游觸發(fā)因子,還需要進(jìn)一步的深入研究。

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(編輯：王寶茹)

Cardio-Protection of Lactate on Post-Conditioning of Acute Myocardial Ischemia Reper fusion in Rats

ZHANG Guo-ming,WANG Yu,LI Tian-de,ZHANG Da-wei,LIU Xiu-hua,LIYu-zhen.
Department of cardiology,Chinese PLA General Hospital,Beijing(100853),China Corresponding Author：WANG Yu,Email：wangyuheart@yahoo.com.cn

Objective：To test the hypotheses of lactate mimicking cardio-protection of post-conditioning by prolonging local acidosis of acutemyocardial ischemia reperfusion in rats.

Methods：Seventy two ratswere randomized into 4 groups：Sham operation group,Reperfusion/in jury(R/Igroup),Post-conditioning(Postgroup),the animatswere treated with 4 cycles of 20/20 s of reperfusion/re-occlusion,and Lactate group,the animatswere treated withmicro-injection of lactate at ischemicmyocardium.There were 18 rats in each group.Blood was taken from right atrium 10minutes after reperfusion tomeasure pH.All rats wereexecuted atdifferent time points to examine the contents of malonic dialdehyde(MDA),superoride dismutase(SOD),and the absorption ofm itochondria inmyocardium.Western blotanalysis was used to analyze the expression of phosphorylated ERK 1/2(P-ERK),Bcl-2 and Bax.Myocardial apoptosis and infarct size were also determined.

Resu lts：Blood pH was sim ilar in Lactate group and Postgroup(P＞0.05)10minutes after the reperfusion.Compared with R/Igroup,themyocardial absorp tion in Lactate group and Post group were both decreased 1h after the reperfusion(P＜0.05),and this phenomenon was attenuated 6h after reperfusion(P＞0.05).The levels ofMDA and SOD inmyocardium were sim ilar in Lactate group and R/Igroup(P＞0.05).The expressions of P-ERK,Bcl-2and Bax in Lactategroup were higher than that in R/Igroup(P＜0.05),but lower than that in Post group(P＜0.05).Myocardial enzyme activity,apoptotic index and infarct size in Lactate group were decreased at different degree,butapop totic index was still higher than that in Post group(P＜0.05).

Conclusion：Lactate could partlym im ic the cardio-protection of post-conditioning,and briefprolonged local acidosis in ischemicmyocardium m ight be one of trigger factors in the complex mechanism of post-conditioning.

Post-conditioning;Reperfusion injury;Lactate;Acidosis;mitochond rail Permeability transition pore

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.30740080)

100853 北京市,中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院 心血管內(nèi)科 (張國(guó)明、王禹、李天德、張大為),病理生理學(xué)研究室 (劉秀華、李玉珍)

張國(guó)明 主治醫(yī)師 博士 主要從事冠心病的基礎(chǔ)和臨床研究 Email：guomingheart@126.com通訊作者 ：王禹 Email：wangyuheart@yahoo.com.cn

R54

A

1000-3614(2010)01-0034-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2010.01.011

2009-07-08)

?臨床研究?