孫 林,霍如松,焦新安

結(jié)核分枝桿菌VII型分泌系統(tǒng)的研究進展＊

孫 林,霍如松,焦新安

細菌的致病性依賴于分泌毒力因子的能力,這些毒力因子可以表達在細胞表面,也可以通過分泌的方式到達細胞外基質(zhì)或者是直接進入宿主細胞。對蛋白分泌機制的研究主要集中在革蘭氏陰性菌,并由此鑒定出了不同的分泌系統(tǒng),分別命名為I-V I型分泌系統(tǒng)。革蘭氏陰性菌的蛋白分泌特別復雜,因為這些細菌都有兩層膜包裹,也就是說分泌的蛋白必須通過內(nèi)膜和外膜這兩層膜才能進入胞外基質(zhì)或者宿主細胞。相對而言,革蘭氏陽性菌結(jié)構(gòu)比革蘭氏陰性菌簡單,因此其分泌的蛋白只需穿過質(zhì)膜和肽聚糖層就可以到達細胞外環(huán)境。

在結(jié)核分枝桿菌(M ycobacterium.tubercu losis)中,有些蛋白(如 T細胞抗原Ag85)含有典型的信號肽序列,這些蛋白的分泌通過Sec途徑進行,還有一些蛋白則通過Sec2旁路途徑或者 Tat途徑進行分泌。然而在結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)濾液中含有很多小分子量、高免疫原性的蛋白,它們都缺少典型的信號肽序列,其中ESA T-6(6 kDa early secreted antigenic target,6 kDa早期分泌抗原靶位)就是這些蛋白的代表。結(jié)核分枝桿菌具有十分復雜的細胞壁結(jié)構(gòu)(圖1),分枝菌酸和細胞壁基質(zhì)共價結(jié)合,形成了高度疏水、幾乎不通透的分枝菌酸膜(mycomembrane,MM),蛋白質(zhì)必須穿過分枝菌酸膜才能分泌到胞外環(huán)境,這就提示在結(jié)核分枝桿菌中可能存在著一種特殊的分泌系統(tǒng)。

圖1 結(jié)核分枝桿菌細胞膜結(jié)構(gòu)示意圖〔1〕Fig.1 Schematic representation of the cell envelope of M.tuberculosis

1 ESX-1分泌系統(tǒng)

在ESX-1分泌系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)之前,通過基于 ESA T-6、CFP-10以及兩側(cè)的膜相關(guān)蛋白和假定A TP酶的基因芯片分析已經(jīng)預測到了這個分泌系統(tǒng)的存在。有關(guān)這個分泌系統(tǒng)的第一個實驗證據(jù)是〔2〕,只有將完整的RD1區(qū)插入BCG疫苗株后,ESA T-6才得以分泌,RD1區(qū)單個基因的破壞(特別是Rv3870,Rv3871和 Rv3877)都將妨礙 ESA T-6和CFP-10的分泌。這個系統(tǒng)現(xiàn)在被稱為 ESA T-6分泌系統(tǒng)或者 ESX-1分泌系統(tǒng),亦被稱為V II型分泌系統(tǒng) (type V II secretion system,T7S system)〔1〕。接著,在魚致病性分枝桿菌海洋分枝桿菌(M.m arinum)和非致病性分枝桿菌恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)中也發(fā)現(xiàn)了ESX-1分泌系統(tǒng)。

2 ESX-1系統(tǒng)的組成及分泌機制

ESX-1系統(tǒng)所包含基因的數(shù)量還存在著爭議,可能在不同種類的分枝桿菌之間存在差異。目前,已經(jīng)鑒定出一些確切參與 ESX-1的蛋白質(zhì)組分,普遍認為 EspA、EspB、EAST-6、CFP-10、M ycP1、PE35、 Rv3614c、 Rv3615c、 Rv3868、 Rv3869、Rv3870、Rv3871、Rv3877、Rv3879c和 Rv3882c等蛋白參與了ESX-1分泌系統(tǒng)的形成。Rv3868是具有AAA+A TP酶位點的假定細胞質(zhì)伴侶蛋白,Rv3883c(M ycP1)是一種枯草桿菌樣絲氨酸蛋白酶,Rv3870和Rv3871可能共同形成FtsK/SpoⅢE類A TP酶。其他參與 ESX-1分泌系統(tǒng)的蛋白質(zhì),如 Rv3869、Rv3877、Rv3881c 以及 Rv3882,它們與已知功能的蛋白之間沒有同源性,但預測其存在于細胞質(zhì)膜上。例如,Rv3877是一種多重跨膜蛋白,能夠在細胞質(zhì)膜上形成蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位孔。Rv3881c(M h3881c)在分泌時C端會被切除,而其C端對協(xié)同分泌具有重要的作用,對 ESA T-6的分泌水平有影響。研究還發(fā)現(xiàn),基因序列 Rv3614c～Rv3616c也參與了ESX-1分泌系統(tǒng)的組成,如果這些基因缺失,即使存在完整的 RD1區(qū),同樣導致 ESA T-6和 CFP-10不能分泌〔3-4〕(圖2)。

圖2 ESX-1分泌系統(tǒng)中的基因〔1〕Fig.2 Genes involved in the ESX-1 secretion sy?stem

ESX-1分泌系統(tǒng)中的相關(guān)蛋白是如何相互作用進而定位和轉(zhuǎn)移出細胞膜和細胞壁的?盡管缺乏結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的支撐,ESX-1分泌系統(tǒng)組分很有可能形成一個類似于細菌 I型—IV型分泌系統(tǒng)的多重跨膜結(jié)構(gòu)。有關(guān)ESX-1分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白相互作用的研究為了解 ESX-1分泌系統(tǒng)的分子機制提供了理論依據(jù)。

分泌的ESA T-6和CFP-10在穩(wěn)定性上互相依賴,并且形成緊密的1∶1的二聚體結(jié)構(gòu)。酵母雙雜交試驗揭示,Rv3870可能與 Rv3871相互結(jié)合,而Rv3871又是與CFP-10結(jié)合的,因此推斷胞漿蛋白Rv3871首先識別 ESA T-6/CFP-10復合物,并與CFP-10的C端結(jié)合,接下來 Rv3871與 Rv3870在細胞內(nèi)膜上相互作用并形成具有活性的A TP酶(圖 3)。分子伴侶 Rv3868可能和 Rv3870和Rv3871相互作用進而促進 ESA T-6和CFP-10蛋白的分泌。Rv3871/Rv3870復合物類似于 I型和IV型分泌系統(tǒng)中的A TP酶,形成一個具有中央空洞的六環(huán)結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)有助于分泌的底物通過分泌通道。Rv3877預測含有11個跨膜結(jié)構(gòu)域,很有可能形成了位于內(nèi)膜(inner membrane,IM)上的轉(zhuǎn)位通道。但是目前還不清楚是什么蛋白或者哪些蛋白形成了分枝菌酸膜上的通道。

當發(fā)現(xiàn) ESX-1分泌系統(tǒng)的第 2個基因簇(Rv3614c～Rv3616c)后,ESX-1的分泌機制變得更加復雜。Rv3616c(EspA)和 ESA T-6、CFP-10是協(xié)同分泌的,共同參與 ESX-1分泌系統(tǒng)。Rv3614c～Rv3616c與 RD1區(qū)域的 Rv3864～Rv3867同源,EspA可能與 Rv3614c和 Rv3615c共同形成操縱子。胞質(zhì)蛋白Rv3614c和胞膜蛋白 Rv3882c相互作用進而促進相關(guān) ESX-1分泌蛋白的分泌(圖3)。Rv3815c是一種分泌蛋白,其C端同CFP-10一樣是分泌系統(tǒng) ESX-1所必需的。在缺少 EspA或Rv3815c時,能有效形成 ESA T-6/CFP-10復合物,但是只能停留在細胞內(nèi)而不能被分泌,這就意味著ESX-1的所有底物(EspA,Rv3815c,ESA T-6和CFP-10)在分泌時是互相依賴的〔3-4〕。

圖3 ESX-1分泌機制模式圖〔1〕Fig.3 Workingmodel for the ESX-1 secretion system

有關(guān)ESX-1的分泌機制還有很多問題無法解決,例如在 ESX-1分泌系統(tǒng)中 M ycP1的作用是什么?雖然 M ycP1對于 ESX-1系統(tǒng)是必需的,但是目前還沒有鑒定出由M ycP1作用的分泌底物。另一個重要的問題是,ESX-1底物是如何穿過分枝菌酸膜的?分枝菌酸膜非常厚,達9-10nm,然而目前經(jīng)預測ESX-1系統(tǒng)中沒有組分位于分枝菌酸膜上。

3 ESX-1分泌系統(tǒng)的作用

ESX-1位于RD1區(qū)域,是結(jié)核分枝桿菌重要的毒力因素,這個區(qū)域在BCG疫苗株中是缺失的〔5〕。如果結(jié)核分枝桿菌缺失功能性的 ESX-1分泌系統(tǒng)將會導致其毒力的降低〔6〕,同樣如果將完整的 ESX-1互補進BCG將會使BCG恢復部分的毒力〔7-8〕。麻風分枝桿菌(M.leprae)也含有 ESX-1分泌系統(tǒng),麻風患者的 T細胞能夠?qū)β轱L分枝桿菌的 ESA T-6發(fā)生強烈的反應〔9〕。但是功能性的 ESX-1分泌系統(tǒng)并不僅僅存在于致病菌中,并且有少數(shù)分枝桿菌,如潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)、田鼠分枝桿菌(M.m icroti)和禽分枝桿菌(M.avium),它們?nèi)鄙貳SX-1的部分區(qū)域,ESA T-6不能被分泌,但依然是致病性的。為什么僅僅在某些種屬的細菌中ESX-1與毒力相關(guān)?或許與非致病菌相比,致病性分枝桿菌中的 ESA T-6/CFP-10具有額外的功能,也有可能是因為致病性分枝桿菌通過 ESX-1系統(tǒng)分泌了其他的蛋白〔1〕。究竟哪些分泌蛋白對于細菌的毒力是至關(guān)重要的,這些蛋白又是怎樣和宿主發(fā)生相互作用的?目前的認識還無法清晰地回答這些問題,這將寄希望于對 ESX-1分泌系統(tǒng)的進一步認識。

4 分枝桿菌中其他的ESX分泌系統(tǒng)

由于結(jié)核分枝桿菌細胞壁結(jié)構(gòu)的特殊性,人們推測結(jié)核分枝桿菌具有獨特的分泌系統(tǒng),但出人意料的是,結(jié)核分枝桿菌含有5個這樣的分泌系統(tǒng)。結(jié)核分枝桿菌基因組含有11-12個由 ESA T-6家族成對基因串聯(lián)而成的基因簇,其中有4個基因簇是大基因座,并且與 ESX-1具有更高的同源性,分別被命名為 ESX-2(Rv3884c～Rv3895c)、ESX-3(Rv0282～Rv0292)、ESX-4(Rv3444c～Rv3450c)和ESX-5(Rv1782～Rv1798)。將不同的分泌系統(tǒng)進行比較發(fā)現(xiàn)有6個基因出現(xiàn)在不同的基因簇中,它們可能是結(jié)核分枝桿菌 T7S系統(tǒng)的核心組分〔10〕,其中兩個組分屬于 ESA T-6家族,一個組分屬于FtsK/Spo IIIE家族,一個枯草桿菌樣絲氨酸蛋白酶,一個具有10-11個跨膜結(jié)構(gòu)域的整合蛋白以及另外的一個膜蛋白。除此之外還發(fā)現(xiàn),有些基因出現(xiàn)在絕大多數(shù)的基因簇中,如編碼 PE、PPE蛋白的基因,而有些基因僅僅出現(xiàn)在特定的分泌系統(tǒng)中。

由于ESX-1和致病性分枝桿菌的毒力相關(guān),因此 ESX-1成為了近年來的研究熱點,然而對于其他ESX系統(tǒng)的研究較少。系統(tǒng)發(fā)生學和比較基因組學研究揭示,分枝桿菌中5種不同的ESX系統(tǒng)是通過基因復制的形式進化而產(chǎn)生的,其順序為ESX-4,ESX-1,ESX-3,ESX-2 以及 ESX-5〔10〕,因此 ESX-4在分枝桿菌中是最古老的 T7S系統(tǒng)。與其他的ESX基因座相比,ESX-4最小,在結(jié)核分枝桿菌中僅為9 870bp,而其他的 ESX基因座一般為14-22kb。同時 ESX-4含有的基因數(shù)目最少,在結(jié)核分枝桿菌中僅含有7個基因,而其他的ESX基因座含有11-18個基因。目前關(guān)于ESX-4的生物功能仍然不清楚,同樣,對于ESX-2的功能也是一無所知。在結(jié)核分枝桿菌中,ESX-2位于ESX-1基因座的下游,盡管 ESX-2片段較大,但是在海洋分枝桿菌中是缺失的。有關(guān) ESX-3的信息比較多,通過基因芯片微陣列分析表明,ESX-3在結(jié)核分枝桿菌的Fe/Zn平衡方面有重要作用〔11〕。然而,ESX-3系統(tǒng)究竟是如何工作的還不清楚。目前對于 ESX-5系統(tǒng)的功能有了一定的認識,相關(guān)數(shù)據(jù)都是通過對海洋分枝桿菌以及斑馬魚幼體感染模型的研究獲得的。Wilbert小組首次證實 ESX-5系統(tǒng)與 PPE蛋白的分泌相關(guān)〔12〕。后來該小組還發(fā)現(xiàn),與野生型海洋分枝桿菌相比,ESX-5缺失株感染人Mφ-1后引起了IL-12p40、IL-6和 TNF-α分泌水平的上調(diào)和 IL-1β分泌水平的下調(diào),因此認為 ESX-5在調(diào)控細胞因子分泌方面有著重要的作用〔13〕。

不同的ESX分泌系統(tǒng)之間是相互獨立的,彼此之間不能互補。ESX-1被刪除后,另外的4種 ESX系統(tǒng)并沒有使結(jié)核分枝桿菌的毒力得到恢復。ESX-5和ESX-1一樣,都參與了結(jié)核分枝桿菌從巨噬細胞的逃逸以及細胞間的傳播〔12,14〕,這就意味著這兩種分泌系統(tǒng)在細胞的感染過程中可能扮演獨立的角色。ESX分泌系統(tǒng)的相互獨立,可能是由于它們不同的進化水平以及基因調(diào)控引起的。

5 其他革蘭氏陽性菌的VII型分泌系統(tǒng)

T7S系統(tǒng)似乎和蛋白質(zhì)的穿膜運輸相關(guān),包括穿過分枝菌酸膜,因此在其他的分枝桿菌屬,如棒狀桿菌和諾卡氏菌中也發(fā)現(xiàn)了類似的分泌系統(tǒng)。但是,令人驚訝的是,一些高 G+C含量的革蘭氏陽性菌,如鏈霉菌,并沒有分枝菌酸膜結(jié)構(gòu),但是也含有類似的T7S系統(tǒng)。最近在金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌中也發(fā)現(xiàn)了 T7S系統(tǒng)。在非致病菌中也存在T7S系統(tǒng)的事實表明,或許 T7S系統(tǒng)最初并不是用于毒力因子的分泌而存在的,可能在進化的過程中獲得了分泌毒力因子的功能,比如產(chǎn)單核細胞增生李斯特菌中的 T7S系統(tǒng)與毒力之間沒有關(guān)系〔15〕。令人費解的是,沒有分枝菌酸層的革蘭氏陽性菌為什么也需要特定的分泌系統(tǒng)?或許這些細菌中的 T7S系統(tǒng)與特定的表面結(jié)構(gòu)或附屬結(jié)構(gòu)的生物合成相關(guān)。

6 總結(jié)與展望

結(jié)核分枝桿菌V II型分泌系統(tǒng)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型分泌系統(tǒng),由一些獨特的蛋白組分構(gòu)成,分泌的主要蛋白都屬于 ESA T-6家族,所有的分泌蛋白在分泌時彼此依賴,并且通過特定的途徑得以分泌。目前人們對這個系統(tǒng)的認識已經(jīng)取得了很大的進展,但是還有許多問題有待進一步闡明。對結(jié)核分枝桿菌ESX分泌機制的深入研究,將為結(jié)核病的預防、診斷和治療提供理論依據(jù)。

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1002-2694(2010)08-0772-04

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＊973項目(2006CB504404)、國家科技重大專項(2008ZX10003-010)和公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(200903027)聯(lián)合資助

焦新安,Email:xajiao@yahoo.com

揚州大學 江蘇省人獸共患病學重點實驗室,揚州225009

2010-05-23;

2010-06-18