李邦印 孫衛(wèi)國 程小星 孫昌文 熊志紅 王仲元 王金河 蘇銳

(解放軍第309醫(yī)院結(jié)核病研究室 北京 100091)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(M ycobacterium tuberculosis)所致的以呼吸道為主的慢性傳染病,是目前危害全球人類健康的主要傳染病之一。全世界每年約有(800～1 000)萬新發(fā)結(jié)核病例。結(jié)核病疫情有日益嚴(yán)重的趨勢,難于防治,主要原因之一是由于對結(jié)核病早期診斷和預(yù)防的不足。獲得攜有足夠信息的結(jié)核分枝桿菌抗原,深入研究結(jié)核菌基因的功能,從分子生物學(xué)角度重新認(rèn)識結(jié)核分枝桿菌凸顯其關(guān)鍵性,并持續(xù)發(fā)掘其免疫診斷工具,變得越來越重要。差減雜交等實驗中發(fā)現(xiàn) Rv2653c(類似于phiRv2)與phiRv1在部分弱毒和無毒分枝桿菌中是缺失的,且鮮有文獻對此進行專門研究[1]。2008年,我們合成了 Rv2653c引物,以 H37Rv基因組DNA為模板,用PCR方法擴增獲得了Rv2653c基因,嘗試在p ET24b載體進行了高效表達研究。本實驗為進一步研究結(jié)核菌的遺傳學(xué)特征和篩選新抗原奠定了基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒來源 菌株:結(jié)核分枝桿菌 H37Rv株來源于生物制品檢定所;E.coli DH5α、E.coli BL 21(DE3),本室保存。質(zhì)粒:表達質(zhì)粒載體p ET-24b(Novagen)。臨床抗血清:5例結(jié)核病患者血清,結(jié)明實驗3項檢測結(jié)果均為強陽性結(jié)果,明確診斷為肺結(jié)核。

1.2 主要試劑 EcoRⅠ,HindⅢ,T4 DNA Lig

ase(New England Biolabs);瓊脂糖、p GEM-T vector System-Ⅰ、IPTG、X-Gal、4 ×dN TP(Promega);Plantinum Taq DNA polymerase(Invitrogen);DNA快速純化試劑(賽百盛公司);蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Sigma);Chelating Sepharose Fast Flow蛋白純化試劑(Amersham Pharmacia);Western blo ting lum ino reagent(Santa cruz);辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人 IgG(北京中山生物制品公司);引物合成和測序服務(wù)(上海生物工程公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設(shè)計 根據(jù)結(jié)核分枝桿菌基因組序列,針對RV 2653c基因設(shè)計一對引物,采用 PCR擴增的方法,以 H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA為模板,擴增目的基因。直接將基因插入克隆載體p GEM-T。正義鏈引物 :5′accggaattcttgacccacaagcgcactaaac;反義鏈引物 :5′gcccaagcttctgtttgctgtcgggttcgtc;兩端分別采用EcoR I和 Hind III限制性酶切位點。

1.3.2 PCR擴增Rv2653c基因 PCR反應(yīng)程序:95℃×5min;94℃×20 s,60℃×20 s,72℃×90 s,32循環(huán);72℃延伸7min。

1.3.3 瓊脂糖電泳回收DNA片段 1.5%瓊脂糖電泳結(jié)束后,用干凈的手術(shù)刀片切下約0.5 kb DNA條帶,放入無菌的eppendrof管中,操作方法參照DNA回收試劑盒說明。

1.3.4 基因克隆與測序 PCR產(chǎn)物與p GEM-T連接,參照p GEM-T vecto r System-Ⅰ產(chǎn)品說明,克隆載體的鑒定初步采用藍(lán)白斑篩選,然后以PCR和限制性內(nèi)切酶酶切的方法鑒定白斑菌落。重組子樣品質(zhì)粒送往測序公司。

1.3.5 構(gòu)建表達載體p ET24b-Rv2與鑒定 EcoRⅠ和 HindⅢ限制性內(nèi)切酶從p GEM-Rv2切下約0.5 kb大小的基因片段與經(jīng)過同樣雙酶切的p ET24b的進行快速連接,然后轉(zhuǎn)化DH5α,克隆篩選與鑒定具體方法均參照《分子克隆實驗指南》。將p ET24b-Rv2重組質(zhì)粒重新測序。

1.3.6 重組蛋白的表達及其產(chǎn)物鑒定 (1)誘導(dǎo)表達:分別將p ET24b-Rv2陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BL21(DE3),挑單克隆轉(zhuǎn)種于5m l含50μg/m l卡那霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃恒溫振蕩器培養(yǎng)過夜,然后以0.5%的比例轉(zhuǎn)接到200 m l含50μg/m l卡那霉素的LB培養(yǎng)液,37℃培養(yǎng)至OD600值約0.8～1.0時,加入 IPTG至終濃度為0.1 mmol/L,誘導(dǎo) 4～5 h。取出 ,冰浴 30min,離心 4 000 rpm ×10min,收集菌體,用 SDS-PAGE電泳方法鑒定表達產(chǎn)物。(2)純化重組蛋白末端攜6個組氨酸,可通過形成配位鍵而與金屬螯合親和層析柱上固定化的某些二價金屬離子(如鎳)結(jié)合。試劑及純化方法參照純化試劑盒的操作按說明書進行。收集純化蛋白,用PEG濃縮后再透析,采用Low ry法定量蛋白濃度。1.3.7 重組蛋白抗原性分析 取純化蛋白進行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)PVDF膜,然后以5例臨床結(jié)核患者血清多抗進行Western blot,采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人 IgG作為二抗,初步分析rRv2653c的特異性。Western blot實驗操作參照《分子克隆實驗指南》和化學(xué)發(fā)光試劑盒說明進行。

2 結(jié)果

2.1 釣取 Rv2653c基因 以 H37Rv基因組DNA為模板,進行 PCR擴增獲得了大小約為0.5 kb的DNA片段。

2.2 Rv2653c的克隆與鑒定

2.2.1 克隆與 PCR擴增鑒定 由結(jié)核菌基因組DNA擴增來的PCR片段經(jīng)純化后直接與p GEM-T連接、轉(zhuǎn)化,挑選單克隆菌落快速提取質(zhì)粒,以此為模板,采用Rv2653c上、下游引物進行PCR擴增;鑒定結(jié)果見圖1。陽性重組子命名為p GEM-Rv2。

2.2.2 酶切鑒定 取重組質(zhì)粒5μl,用 EcoR Ⅰ和HindⅢ雙酶切2 h;1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,重組質(zhì)?？梢郧邢录s0.5 kb的片段見圖1。

2.2.3 序列測定 陽性重組子經(jīng)測定序列如下:與報道的序列一致。

圖1 p GEM-Rv2重組子鑒定

圖2 圖2 p ET24B-Rv2重組子鑒定

2.3 構(gòu)建重組表達載體及其重組蛋白的表達和純化

2.3.1 重組表達質(zhì)粒的鑒定 采用 EcoR Ⅰ和HindⅢ雙酶切方法鑒定重組子(圖2)。發(fā)現(xiàn)均可以得到大小約為0.5 kb的DNA片段,重組子命名為p ET24b-Rv2,重新測定序列,見圖3。序列符合預(yù)期。

2.3.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達與純化 p ET24b-Rv2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL 21(DE3),用 IPTG誘導(dǎo)表達,收集菌體,用 SDS-PA GE電泳鑒定表達產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)重組蛋白產(chǎn)量約占菌體總蛋白的20%左右。采用Chelating Sepharose Fast Flow純化融合蛋白,最后得到的重組蛋白產(chǎn)品純度可以達到90%以上(圖4)。

圖3 p ET24b-Rv2重組子基因序列

圖4 p ET24b-Rv2重組蛋白的表達與純化電泳鑒定圖譜

2.3.3 重組蛋白抗原性分析 對純化的融合蛋白進行Western blot分析,結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示:重組蛋白與與結(jié)核患者血清有較強的反應(yīng)性,有抗原性。

圖5 重組蛋白的western blot分析

3 討論

結(jié)核分枝桿菌基因組的遺傳學(xué)演化史就是微生物適應(yīng)微環(huán)境,與時俱進的歷史,結(jié)核菌不斷演化、進化,以適應(yīng)外環(huán)境和人們對結(jié)核病的處置方式。部分結(jié)核菌菌株測序工作完成后,人們發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌基因組中有很多外來基因,這些基因可能在結(jié)核菌的不同生活時期扮演著不同的角色。

Rv2653c是我們在強毒菌株與弱毒株間進行差減雜交分析得到的1個基因,基因組大小約10 kb,編碼107個氨基酸,其富含脯氨酸,與前噬菌體蛋白phiRv1和phiRv2序列有類似性,其蛋白結(jié)構(gòu)與其他細(xì)菌中噬菌體包裝相關(guān)蛋白類似[2-5],它們在致病性結(jié)核菌如M TB、牛型分枝桿菌等中存在,而在非致病的卡介苗等弱毒株的基因組中丟失,有一定的遺傳學(xué)研究價值,相關(guān)文獻很少。它們在致病菌中出現(xiàn)而在非(弱)致病菌中缺失的表現(xiàn)非同尋常,值得我們進一步去探索它在結(jié)核菌中的功能。目前該蛋白市場上有商品化的國外重組產(chǎn)品,而國內(nèi)沒有相關(guān)的研究。

本研究在大腸埃希菌中高效表達Rv2653c基因,獲得了高效表達的工程菌株,得到純度達到90%以上的重組蛋白。Western blot分析發(fā)現(xiàn),重組蛋白與結(jié)核病患者血清反應(yīng)強烈,這充分說明該重組蛋白的抗原性很好。拋開其遺傳學(xué)的角色概念,該蛋白可能還是一種潛在的診斷用抗原,該蛋白的免疫原性為其血清學(xué)檢測指示了另外的研究方向。

未來,我們將一方面利用現(xiàn)有的重組蛋白做一些有關(guān)其遺傳學(xué)角色的工作,闡述其在結(jié)核菌中的功能;另一方面,我們將進行血清學(xué)特異性分析,并嘗試作為若干抗原成分之一,開展Elispot等方面的實驗,探討其是否可作為一種候選的診斷用抗原。

[1]熊志紅,莊玉輝,李國利.差顯技術(shù)分析結(jié)核桿菌 H37Rv與H37Ra差異表達的基因[J].微生物學(xué)通報,2005,3(2):57-61.

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