龔張斌,金國(guó)琴

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,上海 201203)

胸腺衰老被認(rèn)為是機(jī)體衰老的“指示燈”。自然衰老大鼠 HPA軸功能慢性亢進(jìn),血皮質(zhì)酮濃度異常升高,病理濃度的皮質(zhì)酮能阻滯細(xì)胞周期于 G1期,抑制細(xì)胞增殖,推測(cè)其也是引起胸腺萎縮、免疫功能減退、加速機(jī)體衰老的重要機(jī)制。應(yīng)用補(bǔ)腎藥物能延緩此過(guò)程,但具體機(jī)制仍不明了。本文模擬老年大鼠的高皮質(zhì)酮血癥,制作大鼠擬“衰老”胸腺細(xì)胞模型,從胸腺細(xì)胞增殖、周期和免疫功能角度,進(jìn)一步探討左歸丸延緩胸腺依賴性免疫功能下降的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24h SD乳鼠,160g±10g SD雄性大鼠,清潔級(jí)。上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬 )2008-0016。

1.2 主要儀器和試劑

RealPlex4型熒光定量 PCR儀(Eppendorf CO.,LTD)等。

1.3 大鼠血清的制備及方藥組成

左歸丸:熟地 24g,山藥 12g,枸杞 12g,山茱萸12g,川牛膝 9g,菟絲子 12g,鹿角膠 12g,龜膠 12g。選用 160g±10g SD大鼠,分左歸丸組和空白血清組,按文獻(xiàn)方法制備含藥大鼠血清。

1.4 胸腺基質(zhì)液的制備

無(wú)菌條件下,取 24h新生乳鼠胸腺,按文獻(xiàn)方法培養(yǎng)胸腺基質(zhì)細(xì)胞,待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板孔的 80%后,完全換液,繼續(xù)培養(yǎng) 48h,收集培養(yǎng)上清液,0.22μm濾器過(guò)濾除菌,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 原代培養(yǎng)胸腺細(xì)胞

制備胸腺單細(xì)胞懸液。應(yīng)用大鼠淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞,2500r/min離心 10min,取中層淋巴細(xì)胞,PBS洗滌。取單細(xì)胞懸液接種于 6孔培養(yǎng)板,接種細(xì)胞量為 5×105個(gè) /ml,置 37℃5%CO2培養(yǎng)箱里孵育。24h后洗滌細(xì)胞,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 分組及藥物處理

分組:(1)正常對(duì)照組:含 15%大鼠空白血清;(2)皮質(zhì)酮處理組(簡(jiǎn)稱模型組):含 1×10-5M皮質(zhì)酮藥液,15%大鼠空白血清;(3)皮質(zhì)酮加左歸丸血清組(簡(jiǎn)稱左歸組):含 1×10-5M皮質(zhì)酮藥液,15%大鼠左歸丸藥物血清。以上各組均含 40%胸腺基質(zhì)液。各組在藥物處理 48h后均加入 ConA,終濃度為 5μg/ml,繼續(xù)培養(yǎng) 48h。其中,在胸腺細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中增設(shè) 1組;(4)空白組:含 15%大鼠空白血清,40%胸腺基質(zhì)液,不加 ConA。

1.7 MTT法檢測(cè)胸腺細(xì)胞增殖

于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔中加入 MTT試劑(5mg/ml)20μl,繼續(xù)培養(yǎng) 4h,2500r/min離心 6min,棄上清加入 150μl DMSO,振蕩 10min,酶標(biāo)儀測(cè)定570nm的 OD值。

1.8 PI染色分析細(xì)胞周期分布及流式細(xì)胞儀分析

根據(jù)試劑盒實(shí)驗(yàn)方法,細(xì)胞固定、染色行 FCM分析。激發(fā)波長(zhǎng) Ex=488nm,發(fā)射波長(zhǎng) Em=530nm。每管樣品檢測(cè) 10000個(gè)細(xì)胞,全部數(shù)據(jù)經(jīng)Beckman流式細(xì)胞儀自帶軟件獲取和分析。

1.9 胸腺細(xì)胞各種目的基因 mRNA表達(dá)檢測(cè)

Trizol Reagent抽提 Total RNA。合成 cDNA進(jìn)行 qRT-PCR反應(yīng)。p16引物如下:上游引物:5'-ATGAGTTGGGAGGAGGCAGG-3',下游引物:5'-CGGCGTTTGGAGTGGTAGAA-3'。cdk4引物:上游引物:5'-GATGCTGGAGGTCTGCGAGGAA-3',下游引物:5'-AGAGGCCACGAACATGCAAGT-3'。IL-2引物:上游引物:5'-GCCTCCTACTTATAACACACA-3',下游引 物:5'-CCTTGGGGCTTACAAAAAGAA-3'。內(nèi)參GAPDH引物:上游引物:5'-GGTATCGTGGAAGAACTCATGAC-3',下游引物:5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAC-3'。擴(kuò)增條件:94℃變性 30s,62℃退火 30s,72℃延伸 30s,共30個(gè)循環(huán)。通過(guò) RNA瓊脂糖凝膠電泳對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。采用 SYBR Green熒光定量 PCR試劑盒,取各組 cDNA模板,利用 RealTime-PCR檢測(cè)目的mRNA的 Ct值。反應(yīng)體系為:2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5μl,Forward primer(10μmol/L)1μl,Reverse primer(10μmol/L)1μl,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(0.2μg)5μl,DEPC-ddH2O加至 25μl混勻 ,取 20μl加入 PCR管中。最佳反應(yīng)條件為:95℃ 2min,95℃15s,60℃ 25s,72℃ 45s,共 40個(gè)循環(huán)。每組待測(cè)樣本均設(shè)立 6個(gè)重復(fù),全部反應(yīng)結(jié)束之后,mRNA的變化值按公式:化值按公式:進(jìn)行計(jì)算。

1.10 Western blotting法檢測(cè)胸腺細(xì)胞各種目的蛋白表達(dá)水平

洗滌,細(xì)胞離心,利用蛋白抽提液提取細(xì)胞總蛋白,應(yīng)用改良 Bradford法進(jìn)行定量。取 2μl相同濃度的蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE電泳,利用半干轉(zhuǎn)移電泳槽將膠上蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF膜,封閉加一抗,4℃過(guò)夜,PBST漂洗 4次,二抗孵育,37℃搖床 45min,PBST漂洗 4次。利用 ECL kit檢測(cè)目標(biāo)條帶,X-光片壓片、定影、顯影。成像系統(tǒng)拍片、掃描,待分析。

1.11 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 各組胸腺細(xì)胞的增殖變化

與空白組比較,加入 ConA后正常對(duì)照組胸腺細(xì)胞 OD值顯著升高。與正常對(duì)照組比較,1×10-5M皮質(zhì)酮處理的模型組細(xì)胞 OD值顯著降低;與模型組比較,左歸組細(xì)胞 OD值顯著升高。

表1 各組胸腺細(xì)胞的增殖變化

表1 各組胸腺細(xì)胞的增殖變化

注:與空白組比較:P<0.05,P<0.01;與正常對(duì)照組比較:P<0.05,P<0.01;與模型組比較:＊P<0.05,＊＊P<0.01(下同)

組 別n OD570細(xì)胞培養(yǎng)0h 細(xì)胞培養(yǎng) 120h空 白 組 6 0.618±0.03 0.108±0.02正常對(duì)照組 6 0.610±0.04 0.621±0.05模 型 組 6 0.616±0.03 0.260±0.02左 歸 組 6 0.605±0.04 0.498±0.03＊＊

2.2 各組胸腺細(xì)胞周期的變化

圖1顯示,與正常對(duì)照組比較,模型組胸腺細(xì)胞阻滯于 G1期的細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P<0.01),G2期細(xì)胞數(shù)量顯著下降,但 S期細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異(P>0.05)。與模型組比較,左歸組胸腺細(xì)胞處于G1期的數(shù)量顯著減少,處于S期細(xì)胞數(shù)量升高(P<0.05),G2期細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異。

2.3 各組胸腺細(xì)胞各種目的基因 mRNA表達(dá)的變化

2.3.1 qRT-PCR條件的優(yōu)化 圖2為RealTime-PCR反應(yīng)得到反映核酸擴(kuò)增過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖2可見(jiàn),相關(guān)系數(shù)(R2)及擴(kuò)增效率分別為 0.996、98%,復(fù)孔的重復(fù)性好,證明加樣的誤差小。熔解曲線為單一峰,證實(shí)了產(chǎn)物的特異性。擴(kuò)增曲線呈 S形,符合熒光實(shí)時(shí)定量 PCR實(shí)驗(yàn)優(yōu)化指標(biāo)。

2.3.2 各組胸腺細(xì)胞目的基因 mRNA表達(dá)的變化 與正常對(duì)照組比較,模型組胸腺細(xì)胞 p16 mRNA表達(dá)顯著升高 cdk4,IL-2 mRNA表達(dá)明顯降低。與模型組比較,左歸組 p16 mRNA表達(dá)明顯降低,IL-2 mRNA表達(dá)顯著上升,cdk4 mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 各組胸腺細(xì)胞目的基因 mRNA表達(dá)的變化

表2 各組胸腺細(xì)胞目的基因 mRNA表達(dá)的變化

組 別 n p16/GAPDH cdk4/GAPDH IL-2/GAPDH正常對(duì)照組 6 1.000±0.01 1.000±0.01 1.000±0.05模 型 組 6 3.192±0.13 0.769±0.130.653±0.03左 歸 組 6 1.990±0.12＊＊ 0.828±0.19 1.521±0.05＊＊

2.4 胸腺細(xì)胞各種目的蛋白表達(dá)的變化

與正常對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞 p16蛋白表達(dá)顯著升高,CDK 4、IL-2、IL-2Rα蛋白表達(dá)降低。與模型組比較,左歸組細(xì)胞 p16蛋白表達(dá)顯著降低,IL-2、IL-2Rα蛋白表達(dá)顯著升高,CDK4蛋白表達(dá)有升高趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 各組胸腺細(xì)胞目的蛋白表達(dá)的變化

表3 各組胸腺細(xì)胞目的蛋白表達(dá)的變化

組 別 n p16/GAPDH CDK4/β-actin IL-2/GAPDH IL-2Rα/β-actin正常對(duì)照組 6 0.509±0.19 0.783±0.11 0.714±0.10 0.813±0.12模 型 組 6 1.887±0.42 0.677±0.05 0.482±0.08 0.368±0.16左 歸 組 6 0.946 ±0.20＊＊ 0.694±0.08 0.784±0.11＊＊ 0.634±0.08＊＊

圖1 各組胸腺細(xì)胞周期的變化

圖2 GAPDH基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 各組胸腺細(xì)胞目的蛋白表達(dá)變化的Western blot圖

3 討論

細(xì)胞衰老表現(xiàn)為增殖能力下降,生長(zhǎng)不可逆停滯。細(xì)胞增殖能力的關(guān)鍵是順利通過(guò)細(xì)胞周期各個(gè)控制點(diǎn)。不同細(xì)胞周期受不同亞型細(xì)胞周期素及周期素依賴型蛋白激酶控制,從而表現(xiàn)出不同的增殖刺激因素易感性。胸腺細(xì)胞增殖能力與胸腺依賴性免疫功能關(guān)系密切,免疫功能可由胸腺細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力來(lái)評(píng)價(jià),反之細(xì)胞因子的分泌合成也調(diào)節(jié)胸腺細(xì)胞的增殖過(guò)程。IL-2放大 IL-2R基因的表達(dá),后者通過(guò)蛋白酪氨酸激酶(PTK)通路,最終活化 CDK并激活周期素 E,調(diào)節(jié)胸腺細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育,激活胸腺細(xì)胞從 GO進(jìn)入 G1期從而增殖。

G1期限制點(diǎn)是真核細(xì)胞接受外界增殖和抑制增殖信息的重要調(diào)控點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,應(yīng)用 1×10-5M皮質(zhì)酮直接作用于胸腺細(xì)胞后,細(xì)胞顯著阻滯于 G1期,G2期細(xì)胞數(shù)量顯著下降,出現(xiàn)細(xì)胞衰老的變化特點(diǎn)。p16-CyclinD/CDK4-pRb通路中各基因的表達(dá)及功能的改變可能是決定細(xì)胞衰老進(jìn)程的最重要因素。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)皮質(zhì)酮作用后,胸腺細(xì)胞p16基因的表達(dá)顯著升高,CDK4表達(dá)明顯降低,以致細(xì)胞停滯于 G1期。IL-2是誘導(dǎo) T細(xì)胞活化最重要的細(xì)胞因子,IL-2含量下降又是胸腺細(xì)胞衰老的結(jié)果。IL-2與高親和力 IL-2R的相互作用在免疫系統(tǒng)發(fā)育和調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞免疫中起著關(guān)鍵作用。IL-2R的 a亞單位即 CD25分子,是 T細(xì)胞中期活化的標(biāo)志。在 ConA刺激下,皮質(zhì)酮顯著降低胸腺細(xì)胞IL-2、IL-2Rα的表達(dá)量,說(shuō)明皮質(zhì)酮能抑制胸腺細(xì)胞活化的信號(hào)傳導(dǎo)通路,降低胸腺依賴性免疫功能。

應(yīng)用補(bǔ)腎益氣類方藥調(diào)整胸腺細(xì)胞增殖能力,提高胸腺依賴性免疫功能,符合中醫(yī)扶正固本延緩衰老的治則。左歸丸根據(jù)陰陽(yáng)互根理論,陽(yáng)中求陰,陰陽(yáng)并調(diào),為治療腎虛衰老的經(jīng)典方。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),采用左歸丸含藥鼠血清干預(yù)后,G1期細(xì)胞數(shù)量下降,S期細(xì)胞數(shù)量增加,說(shuō)明左歸丸血清能一定程度緩解皮質(zhì)酮對(duì)胸腺細(xì)胞 G1期阻滯的程度,并提示其作用的周期時(shí)相可能位于 G1期,從而提高細(xì)胞增殖能力。同時(shí)發(fā)現(xiàn),p16基因表達(dá)有顯著回調(diào),而CDK4表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此推測(cè),左歸丸鼠血清主要能通過(guò)抑制 p16基因的表達(dá),減輕皮質(zhì)酮對(duì)胸腺細(xì)胞周期阻滯的作用,從而促進(jìn)胸腺細(xì)胞合成分泌 IL-2,后者又促進(jìn)和放大 IL-2R基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),進(jìn)而延緩胸腺細(xì)胞依賴性免疫功能的退化。以上結(jié)果表明,皮質(zhì)酮能抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá),提高凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致胸腺免疫功能退化;而左歸丸可通過(guò)改善這些調(diào)控蛋白的表達(dá),而影響胸腺細(xì)胞的增殖進(jìn)程,延緩胸腺免疫功能退化。