張 澤,武 蕓

(1.湖北民族學(xué)院 附屬醫(yī)院，湖北 恩施 445000；2.生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北民族學(xué)院)，湖北 恩施 445000)

五鶴續(xù)斷屬于川續(xù)斷科植物(Dipsacusasper)，其藥用部位為干燥根，是川續(xù)斷中的優(yōu)質(zhì)品[1]，具有補(bǔ)肝益腎，續(xù)接筋骨，抗骨質(zhì)疏松，止血安胎等功效，臨床上主要用于治療腰膝酸軟，跌打損傷，骨折，腰椎骨質(zhì)增生，先兆性流產(chǎn)和習(xí)慣性流產(chǎn)等癥狀[2].五鶴續(xù)斷多糖、總皂甙和總生物堿含量較高[3～5]，其根的熱水提取物中存在著抗補(bǔ)體多糖和具免疫調(diào)節(jié)活性的高分子活性成分[6]，其提取物有促進(jìn)骨損傷愈合作用的活性成分[7]，續(xù)斷中的總生物堿能顯著抑制子宮平滑肌的自發(fā)收縮活動(dòng)，因此,在臨床上可用來(lái)治療先兆性流產(chǎn)和習(xí)慣性流產(chǎn)等癥狀[8].五鶴續(xù)斷愈傷組織的誘導(dǎo)已有研究[9]，但組織培養(yǎng)的研究國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道.本研究用莖尖及多種外植體為材料，旨在解決品種退化問(wèn)題，保證道地藥材的品質(zhì)并為其擴(kuò)大種植提供一條有效途徑，同時(shí)還為進(jìn)一步采用生物技術(shù)進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)作好技術(shù)準(zhǔn)備.

1 材料和方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用五鶴續(xù)斷均來(lái)自生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北民族學(xué)院)植物培養(yǎng)室.

1.2 方法

1.2.1 外植體處理 挑選健壯的五鶴續(xù)斷植株，取其莖尖、幼嫩的莖和葉作為外植體，用洗潔精清洗干凈后，流水沖洗2 h，用濾紙吸去多余的水分，在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精中消毒30 s左右，用無(wú)菌水沖洗3遍，再轉(zhuǎn)入0.1%的升汞溶液中振蕩消毒：莖尖6 min、莖8 min、葉6 min，無(wú)菌水沖洗3次，然后置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，切除藥液接觸過(guò)的傷口并剝?nèi)デo的外表皮，切成0.5 cm長(zhǎng)的小段，葉切成0.5 cm見方的正方形，接種于附加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)及其組合的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng).所有MS培養(yǎng)基中均添加6.0 g/L瓊脂和20 g/L蔗糖，pH在滅菌前調(diào)至6.0～6.1.培養(yǎng)條件均為溫度23～25℃、光照強(qiáng)度40 μmol·m-2·s-1、光照時(shí)間12 h/d.

1.2.2 初代培養(yǎng) 接種外植體的MS培養(yǎng)基，附加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)及其組合，研究其對(duì)外植體愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)，從而篩選出誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基.每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種4塊外植體，30 d后計(jì)算出愈傷組織塊數(shù)和誘導(dǎo)率[3].誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的外植體塊數(shù)/接種外植體的塊數(shù)×100%.

1.2.3 叢生芽誘導(dǎo) 用NAA(0.1、0.3、0.5、0.7、1.0)mg/L和6-BA(1.0、1.5、2.0)mg/L的不同配比，添加到MS基本培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)叢生芽的產(chǎn)生.每個(gè)處理接種40塊生長(zhǎng)比較一致的愈傷組織，培養(yǎng)30 d后測(cè)定平均出芽數(shù)[10].

注：-：死亡,+：生長(zhǎng)勢(shì)差，++：生長(zhǎng)勢(shì)一般，+++：生長(zhǎng)勢(shì)較好，++++：生長(zhǎng)旺盛，以下同上.

圖1 五鶴續(xù)斷愈傷組織的增殖曲線

1.2.4 生根培養(yǎng) 將高2 cm左右的芽苗剪下，轉(zhuǎn)入到1/2MS生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中附加激素(NAA和多效唑)、6.0 g/L瓊脂和20 g/L蔗糖，pH5.8.每個(gè)處理接種30根芽苗，30 d后測(cè)定平均生根數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合的誘導(dǎo)效應(yīng)

將外植體接種到NAA+6-BA和2,4-D+6-BA兩種組合的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行初代培養(yǎng)，結(jié)果表明(見表1)，MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.1 mg/L和MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L的愈傷誘導(dǎo)效果較好，其誘導(dǎo)率分別達(dá)到了92.5%和91.7%，但愈傷組織在色澤、質(zhì)地和生長(zhǎng)勢(shì)方面均表現(xiàn)不同，前者所得愈傷組織呈深綠色、質(zhì)地較好，生長(zhǎng)較快，適合于快速繁殖；后者誘導(dǎo)的愈傷呈黃綠色，質(zhì)地較硬，不利于快繁.因此，MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L為初代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基.

2.2 不同外植體的誘導(dǎo)效應(yīng)

不同類型外植體誘導(dǎo)愈傷組織的效果不同：莖尖、幼嫩的莖段和葉作為外植體都能誘導(dǎo)出愈傷組織，其誘導(dǎo)率分別為76.67%、83.33%和40.00%，其中以莖尖和幼嫩的莖段誘導(dǎo)愈傷率較高，生長(zhǎng)勢(shì)好；葉誘導(dǎo)愈傷率較低，愈傷呈黃色泡狀，繼代后死掉了，不適于用作快繁的外植體.莖尖培育的幼苗可達(dá)到脫毒效果，能有效防止品種退化，因此，莖尖是較理想的外植體.

2.3 光照的影響

用誘導(dǎo)愈傷組織的最優(yōu)培養(yǎng)基MS+6-BA1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L進(jìn)行繼代培養(yǎng).每瓶接種鮮重1 g且色澤一致的愈傷組織，一部分置于光強(qiáng)為40 μmol·m-2·s-1，12 h/d，溫度為25℃左右條件下培養(yǎng)；另一部分置于暗培養(yǎng)箱中對(duì)照培養(yǎng).每3 d取兩種條件下培養(yǎng)的愈傷組織稱重，計(jì)算愈傷組織的鮮重，并重復(fù)3次，取其平均值，其結(jié)果如圖1所示.

研究結(jié)果顯示，其愈傷組織的生長(zhǎng)可明顯地分為3個(gè)時(shí)期：延遲生長(zhǎng)期(0～9 d)、指數(shù)生長(zhǎng)期(9～24 d)和靜止(24～30 d)期.愈傷組織在延遲期生長(zhǎng)緩慢，在指數(shù)生長(zhǎng)期愈傷組織鮮重急劇增加，在靜止期愈傷組織鮮重增加幾乎停止，由此可見愈傷組織在光照下長(zhǎng)勢(shì)好，并且愈傷組織的顏色呈深綠色,結(jié)構(gòu)較疏松；在暗培養(yǎng)中愈傷組織呈黃白色，長(zhǎng)勢(shì)較慢.

2.4 叢生芽誘導(dǎo)

用生長(zhǎng)較一致的綠色愈傷組織為材料，用6-BA和NAA的不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)誘導(dǎo)叢生芽產(chǎn)生，結(jié)果表明(見表2)，培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L誘導(dǎo)叢生芽個(gè)數(shù)最高，芽苗生長(zhǎng)健壯，因此，MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L為誘導(dǎo)叢生芽的最優(yōu)培養(yǎng)基.

表2 不同激素配比誘導(dǎo)叢生芽的效果(質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為mg/L)

表3 不同激素配比誘導(dǎo)生根的效果(質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為mg/L)

2.5 生根培養(yǎng)

用IBA和多效唑(PP333)的不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)誘導(dǎo)五鶴續(xù)斷生根，結(jié)果表明(見表3)：?jiǎn)为?dú)使用IBA時(shí)可以誘導(dǎo)生根，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4 mg/L時(shí)最佳；在培養(yǎng)基中添加多效唑(PP333)后可促進(jìn)生根，使生根數(shù)大大增加，綜合考慮因素IBA和PP333的影響，誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.4 mg/L+PP3330.4 mg/L.

2.5 煉苗與移栽

將生根后的芽苗長(zhǎng)到高5～6 cm、根長(zhǎng)約3 cm時(shí)開始煉苗.先打開培養(yǎng)瓶蓋，置于室溫散射光下，補(bǔ)加適當(dāng)?shù)恼麴s水進(jìn)行煉苗.煉苗3～4 d后取出試管苗，洗去根部培養(yǎng)基，移栽入裝有滅過(guò)菌的草炭+蛭石(2∶1)的花盆中，并適時(shí)澆以霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液，放入溫室中培養(yǎng)，濕度保持90%左右，三周后移栽.移栽后每天至少兩次噴灑適量水(土潤(rùn)濕為止)，移栽后的小苗注意保濕、遮蔭和適當(dāng)通風(fēng)，小苗成活率可達(dá)85%以上.

3 結(jié)論

在五鶴續(xù)斷組織培養(yǎng)過(guò)程中，以莖尖為外植體可避免內(nèi)生菌的產(chǎn)生，是較理想的實(shí)驗(yàn)材料.莖尖產(chǎn)生的愈傷組織分化較好，是防止品種退化的最有效途徑.本研究確定了五鶴續(xù)斷組織培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為：

1)初代培養(yǎng)基MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L；

2)叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L；

3)生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA 0.4 mg/L+PP3330.4 mg/L.

[1]武蕓,丁莉,周吉源.五鶴續(xù)斷的研究概況與開發(fā)前景[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)報(bào),2004,21(4):31-33.

[2]全國(guó)中草藥匯編寫組.全國(guó)中草藥匯編(下冊(cè))[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000：135-136.

[3]武蕓.五鶴續(xù)斷多糖的提取及動(dòng)態(tài)分布規(guī)律的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(6)：1 325-1 326.

[4]武蕓.五鶴續(xù)斷中總皂甙提取工藝優(yōu)化[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2008,19(4)：826-827.

[5]武蕓.五鶴續(xù)斷中總生物堿提取分離工藝的初探[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2008,19(2)：708-709.

[6]嚴(yán)忠紅.川續(xù)斷根部免疫調(diào)節(jié)多糖的分離和化學(xué)性質(zhì)[J].植物學(xué)分冊(cè),1998,13(3):122-123.

[7]紀(jì)順心,吳雪琴,李崇芳.中藥續(xù)斷對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性骨損傷愈合作用的觀察[J].中草藥,1997,28(2):98-99.

[8]龔曉健,季暉,王青,等.川續(xù)斷總生物堿對(duì)妊娠大鼠子宮的抗致痙及抗流產(chǎn)作用[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1997,29(6):459-461.

[9]武蕓,丁莉,韓鴻，等.五鶴續(xù)斷愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(13):5 877-5 878.

[10]武蕓,鄭小江,武玉蓮，等.恩五葉蜜甜味絞股藍(lán)快反體系的建立與優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,49(1)：27-30.