孫 濤, 銀旭紅, 姚 倩, 周冬香, 邵則淮

(上海海洋大學 食品學院, 上海 201306)

低聚羧甲基殼聚糖的抗氧化性能

孫 濤, 銀旭紅, 姚 倩, 周冬香, 邵則淮

(上海海洋大學 食品學院, 上海 201306)

將低聚殼聚糖(chitosan oligosaccharide, COS)醚化得到O-羧甲基殼聚糖(O-carboxymethyl chitosan oligosaccharide,O-CMCOS)和N-羧甲基殼聚糖(N-carboxymethyl chitosan oligosaccharide,N-CMCOS), 其取代度(substituting degree, DS)均為0.54, 用紅外光譜對其結構進行表征。同時, 考察了其結構對超氧陰離子的清除活性以及還原能力。結果表明, COS及其衍生物清除超氧陰離子的活性及還原能力的強弱順序均為：O-CMCOS＞COS＞N-CMCOS。

低聚殼聚糖; 羧甲基殼聚糖; 取代度; 抗氧化; 還原能力

甲殼素是自然界存儲量僅次于纖維素的第二大天然多糖, 廣泛存在于甲殼動物外殼、某些植物及真菌類細胞壁中, 其脫乙酰基為殼聚糖。殼聚糖具有良好的生物相容性、可生物降解性等多種生物活性, 在食品、化工、環(huán)保和生物醫(yī)學等領域的應用研究取得了重大進展[1～3]。羧甲基殼聚糖是殼聚糖經羧甲基化后的一類殼聚糖衍生物。根據羧甲基的取代位置不同, 可以分為O-羧甲基殼聚糖、N-羧甲基殼聚糖和N,O-羧甲基殼聚糖。羧甲基在多糖主鏈上取代的位置和程度都會直接影響到羧甲基殼聚糖的各種性能, 是殼聚糖在生產、研究和應用中的重要技術指標。有關羧甲基殼聚糖的取代位置、取代度及其功能之間關系的研究, 尚未見很多報道。

本實驗以低聚殼聚糖(Chitosan oligosaccharide,COS)為原料, 制備了相同取代度的O-羧甲基殼聚糖(O-CMCOS)和N-羧甲基殼聚糖(N-CMCOS), 并研究了其結構對抗氧化能力的影響。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

低聚殼聚糖(分子質量為5 ku), 購自浙江金殼生物化學有限公司; 魯米諾, 硼氫化鈉, 乙醛酸, 購自Sigma公司; 其余試劑均為分析純, 購自上?；瘜W試劑公司; 抗氧化測試所需溶液由二次蒸餾水配制。

作為減速器或變速器的傳動部件[1],行星機構具有體積小、質量輕、結構緊湊、傳動速比大、載荷分布均勻以及承載能力強等優(yōu)點,廣泛應用于航空、車輛及工程機械設備中.在所有行星機構中內外嚙合單排行星機構是最基本的組成要素,其設計過程要滿足嚴格的配齒條件,否則將因相互干涉而不能裝配構成行星機構,最終導致設計任務失敗.本文將基于齒輪傳動理論,運用數學方法討論內外嚙合單排行星機構的配齒條件,為工程技術人員提供成熟的解決方案.

79-3型恒溫磁力攪拌器, 上海司樂儀器有限公司; DELTA-320-S型pH計, 梅特勒-托利多儀器上海有限公司; DDS-307 電導率儀, 上海精密科學儀器有限公司; UV-2000型紫外可見分光光度計, 尤尼柯上海儀器有限公司; FFM-D型流動注射式化學發(fā)光儀, 西安瑞邁電子科技有限公司;EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀, 德國BRUKER公司。

1.2 羧甲基殼聚糖的制備及表征

1.2.1 O-羧甲基殼聚糖的制備

紅外光譜在 EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀上進行, 采用 KBr壓片法制樣, 測定波數范圍為500～4000 cm-1, 分辨率為0.8 cm-1。取代度通過電位滴定法測得[6]。

1.2.2 N-羧甲基殼聚糖的制備

對超氧陰離子的清除根據文獻[7]測定并稍做改進。用pH為10.20的0.5 mol/L Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制濃度為1.5×10-3mol/L的魯米諾溶液, 用1×10-3mol/L的鹽酸配制濃度為0.1 mol/L的鄰苯三酚儲備液, 使用前用去離子水稀釋至1×10-4mol/L。以緩沖液作為溶劑, 配制成不同濃度的樣品溶液。用流動注射化學發(fā)光分析儀依次測定從稀到濃的樣品溶液, 讀出峰面積。清除率=(A0－Ai)/A0×100%。式中A0為空白溶液峰面積;Ai為樣品溶液峰面積。經SOD、過氧化氫酶及甘露醇檢測, 該體系產生的自由基為超氧陰離子。

將5.0 g殼聚糖加入到50 mL42%NaOH溶液中,在室溫下邊攪拌邊分別加入5.35、2.5和1.0 g氯乙酸, 反應28 h后, 用1∶1 HCl調節(jié)pH至7, 然后用無水乙醇沉淀并多次浸泡洗滌。最后60 ℃真空干燥,即得到白色的O-羧甲基殼聚糖[4]。

伴隨著同一理性的自我分裂，工具理性的異化成為影響社會生活的引人矚目的現象，當代西方思想家對其進行了深度的批判和反省，彰顯了理性的批判性和超越性力量。

1.3 對超氧陰離子的清除

將4 g殼聚糖加入到含有0.2 g乙醛酸的150 mL的水溶液中, 攪拌反應2 h。用10%的NaOH調節(jié)pH至9, 然后加入10 mL10%的NaBH4, 繼續(xù)攪拌2 h,然后調pH至中性, 然后用無水乙醇沉淀并多次浸泡洗滌, 最后60 ℃真空干燥, 即得到白色的N-羧甲基殼聚糖[5]。

1.4 還原能力的測定

還原能力根據文獻[8]測定并稍做改進。取2.0 mL不同濃度的樣品, 加入pH為6.60的0.2 mol/L磷酸緩沖液1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL, 混勻, 50 ℃水浴20 min后迅速冷卻, 加入2.5 mL10%三氯乙酸溶液,混勻后在2000 r/min下離心10 min, 取上清液2.0 mL,加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液, 靜置10 min后在700 nm處測定吸光度。

2 結果與討論

2.1 紅外光譜及取代度

圖1 COS, O-CMCOS和N-CMCOS的紅外光譜Fig. 1 FTIR spectra of COS, O-CMCOS and N-CMCOS

2.2 對超氧陰離子的清除

圖1是COS,O-CMCOS和N-CMCOS的紅外光譜圖。如圖所示, 所有樣品均在1 100 cm-1附近有較強的多糖特征吸收峰。其中1 030 cm-1和1 074 cm-1附近吸收峰分別是分子中伯羥基和仲羥基伸縮振動的結果。這兩個吸收峰在O-CMCOS譜圖中強度明顯減弱, 由此說明 COS的伯羥基和仲羥基發(fā)生了羧甲基化反應。3 400 cm-1-OH吸收峰明顯變窄, 這是由于C6位上-OH發(fā)生了醚化反應, -OH減少而引起的。在N-CMCOS的譜圖中, 伯胺 N-H面內彎曲振動在1 612 cm-1處吸收峰均有減弱, 說明了在N位發(fā)生了羧甲基的取代反應[9]。經過電位滴定法測試,O-CMCOS和N-CMCOS的取代度均為 0.54, 這說明羧甲基取代O-CMCOS羥基和N-CMCOS氨基的程度相同。

“農區(qū)變景區(qū)、田園變公園、民房變客房”。當前，不少地方都把發(fā)展休閑農業(yè)和鄉(xiāng)村旅游作為實施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的主要抓手，觀光農業(yè)園區(qū)、森林人家、康養(yǎng)基地、鄉(xiāng)村民宿等新業(yè)態(tài)層出不窮。例如，北京農業(yè)嘉年華、江蘇高淳國際慢城、陜西涇渭茯茶特色小鎮(zhèn)等利用農村閑置土地和農民閑暇時間，不僅讓閑置的土地“忙”起來，農民的錢包鼓起來，更讓傳統鄉(xiāng)村文化“火”了起來。

第二，時刻關注林業(yè)資源的動態(tài)變化。木本植物消失、成長是影響林業(yè)資源整體變化的重要因素，在此基礎上，林業(yè)資源還受到水資源、經濟發(fā)展水平、農業(yè)建設進程、相關部門管理方案等因素的影響。對此，這就需要林業(yè)部分不定期對林業(yè)資源進行質量檢查，深入到森林實處之內進行全方位的調研，從而全面把握林業(yè)資源的總體情況，為林業(yè)局林政資源管理方案的生成提供必要依據。

圖2 COS、O-CMCOS和N-CMCOS對超氧陰離子的清除Fig. 2 Scavenging effects of COS, O-CMCOS and N-CMCOS on superoxide anion

2.3 還原能力的測定

還原能力和抗氧化活性之間有著密切的關系?？寡趸镔|通過提供電子阻斷 Fe2+向 Fe3+的轉變,表現出一定的還原能力, 同樣也可以通過提供電子和自由基反應, 表現出抗氧化活性。COS及其衍生物的還原能力如圖3所示。隨著濃度的增加, 各樣品的吸光值隨之增加, 還原能力逐漸增強。當質量濃度為2.0 g/L時, COS、O-CMCOS和N-CMCOS的吸光度分別是0.72、0.96和0.65。即COS及其衍生物的還原能力大小順序為：O-CMCOS＞COS＞N-CMCOS。

圖3 COS、O-CMCOS和N-CMCOS的還原能力Fig. 3 Reducing power of COS, O-CMCOS and N-CMCOS

3 結論

本實驗通過對COS進行醚化, 制備了取代度均為 0.54的O-CMCOS和N-CMCOS?？寡趸瘻y試結果表明：COS及其衍生物對超氧陰離子的清除能力與還原能力的順序大小均為：O-CMCOS＞COS＞N-CMCOS。殼聚糖以及衍生物抗氧化能力的大小與活性羥基和氨基密切相關。低聚殼聚糖由于主鏈上的β-(1,4)糖苷鍵發(fā)生斷裂, 更多的活性羥基基團暴露出來, 因而具有良好的抗氧化能力。在COS分子鏈上引入羧甲基后, 由于-CH2COO-是推電子基團,它可以使活性羥基和氨基的電子云密度增大, 更有利于活性羥基和氨基與自由基反應, 故O-CMCOS的抗氧化活性與 COS相比有所增強。而對于N-CMCOS來說, 羧甲基的引入雖然使活性氨基和羥基的電子云密度增大, 但同時也減少了游離氨基的含量, 所以N-CMCOS的抗氧化活性相對最弱。這一結果也說明氨基在COS及其衍生物抗氧化活性中的重要性。

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Antioxidant activity of carboxymethyl chitosan oligosaccharide

SUN Tao, YIN Xu-hong, YAO Qian, ZHOU Dong-xiang, SHAO Ze-huai
(College of Food Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Feb. ,28, 2009

chitosan oligosaccharide; carboxymethyl chitosan oligosaccharide; substituting degree; antioxidant activity; reducing power

O-carboxymethyl chitosan oligosaccharide (O-CMCOS) andN-carboxymethyl chitosan oligosaccharide(N-CMCOS) with the same substituting degree (0.54) of carboxymethyl group were prepared by the etherification of chitosan oligosaccharide (COS), with their structures characterized by FTIR spectra. The orders of COS,O-CMCOS andN-CMCOS scavenging effect on superoxide anion and reducing power wereO-CMCOS＞COS＞N-CMCOS.

TS202.3 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3096(2010)02-0054-03

2009-02-28;

2009-06-29

上海市教育委員會科研項目(07zz134); 上海市重點學科建設專項基金項目(T1102)

孫濤(1970-), 女, 博士, 副教授, 研究方向：生物化學, 電話：021-61900363, E-mail：taosun@shou.edu.cn

康亦兼)