■ 毛華東 王 娜 隋 超 劉正勇 張聃煬 陳京華

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266000）

魚粉蛋白質(zhì)含量高且氨基酸組成合理，一直是水產(chǎn)飼料中最優(yōu)質(zhì)的蛋白源，然而由于供不應(yīng)求導(dǎo)致價(jià)格高昂，不得不減少其在水產(chǎn)飼料中的用量[1]。豆粕、菜粕、棉粕和花生粕是當(dāng)前替代魚粉的主要植物蛋白源，其供應(yīng)相對(duì)充足且價(jià)格便宜，然而植物蛋白源的氨基酸組成往往不平衡，其中蛋氨酸通常是飼料中主要的限制性氨基酸之一[2]。除了參與機(jī)體蛋白質(zhì)合成外，蛋氨酸還在多種生理反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用，如轉(zhuǎn)甲基化、抗氧化和免疫細(xì)胞的增殖和分化等[3-5]。蛋氨酸含量不足通常會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物出現(xiàn)生長(zhǎng)性能下降、飼料利用率降低、機(jī)體氧化應(yīng)激和系統(tǒng)代謝紊亂等問題[6-8]。在魚粉含量低的水產(chǎn)飼料中往往需要額外補(bǔ)充蛋氨酸，以便提高魚蝦的生長(zhǎng)性能和飼料效率[9]。

綠鰭?cǎi)R面鲀（Thamnaconus septentrionalis），隸屬于鲀形目（Tetraodontiformes），單角鲀科（Monoceratidae）[10]，又名馬面魚、橡皮魚。其肉質(zhì)肥美，鮮而不膩，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[11]。由于受過度捕撈的影響，綠鰭?cǎi)R面鲀的漁獲量在逐漸降低[12]，無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的消費(fèi)需求。綠鰭?cǎi)R面鲀的人工育苗技術(shù)已經(jīng)取得了突破，可以在山東、江蘇、福建等沿海地區(qū)進(jìn)行養(yǎng)殖[13]。由于其不能在北方海域自然越冬，也難以在南方海域自然度夏，南北網(wǎng)箱接力式養(yǎng)殖是目前最有優(yōu)勢(shì)的養(yǎng)殖模式之一。綠鰭?cǎi)R面鲀性情溫和，游泳緩慢，口徑小，捕食能力很弱[14-16]，目前人工養(yǎng)殖中主要投喂冰凍糠蝦，尚未開發(fā)出商業(yè)配合飼料。本試驗(yàn)通過研究DL-蛋氨酸對(duì)綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚生長(zhǎng)、免疫和抗氧化能力的影響，得出綠鰭?cǎi)R面鲀飼料中蛋氨酸的最適需求量，為開發(fā)綠鰭?cǎi)R面鲀商業(yè)配合飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料配制

以紅魚粉、雞肉粉、血粉、豆粕、棉粕、大豆?jié)饪s蛋白為蛋白源，以魚油、豆油、大豆磷脂油為脂肪源，配制出基礎(chǔ)飼料配方。在基礎(chǔ)飼料配方中分別添加0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%DL-蛋氨酸（贏創(chuàng)德固賽公司提供，含量99%），配制出6 種等氮、等能飼料。所有原料均過80 目篩，先將粉狀原料混勻，然后加入復(fù)合油脂混勻，使用FT36-28D 雙螺桿膨化機(jī)制成緩沉型膨化飼料，在恒溫干燥箱中于60 ℃烘至水分含量8%左右。實(shí)驗(yàn)飼料營(yíng)養(yǎng)組成和氨基酸組成見表1和表2。

表1 試驗(yàn)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

表2 試驗(yàn)飼料實(shí)測(cè)氨基酸組成（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

1.2 試驗(yàn)用魚和養(yǎng)殖管理

試驗(yàn)用綠鰭?cǎi)R面鲀魚苗購(gòu)自山東省威海市銀澤生物科技股份有限公司。養(yǎng)殖地點(diǎn)位于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院養(yǎng)殖中心，試驗(yàn)開始前魚苗暫養(yǎng)2 周，投喂海水魚配合飼料（青島七好營(yíng)養(yǎng)科技有限公司生產(chǎn)），其間及時(shí)淘汰運(yùn)輸過程中受傷及狀態(tài)不佳的魚苗。分組前魚苗禁食24 h，將540 尾大小均勻、狀態(tài)良好的魚苗[平均初始體重（3.50±0.02） g]按照每缸30 尾分配到18 個(gè)玻璃魚缸中（80 cm×70 cm×60 cm）。將6種試驗(yàn)飼料隨機(jī)分配給18個(gè)缸，每種飼料3 個(gè)重復(fù)。養(yǎng)殖系統(tǒng)配有紫外消毒系統(tǒng)、恒溫加熱系統(tǒng)、斷電報(bào)警系統(tǒng)、緊急供氧氣泵和糞便過濾系統(tǒng)。試驗(yàn)用水為經(jīng)壓力過濾器過濾的地下海水，水溫保持在21～23 ℃，鹽度20‰～22‰，溶解氧＞7 mg/L，自然光照周期。日換水兩次（10：00 和20：00），日換水率大于100%，每日飽食投喂3 次（07：00、13：00 和18：00），養(yǎng)殖周期12周。

1.3 樣品采集和指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)所有動(dòng)物處理程序都經(jīng)過了青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，將試驗(yàn)魚禁食24 h，計(jì)數(shù)每缸魚的尾數(shù)并稱重，然后用丁香酚（1∶10 000）麻醉。每缸隨機(jī)取3尾魚用封口袋分裝，置于-80 ℃冰箱保存用于測(cè)定魚體成分。取3 尾魚，測(cè)量其體長(zhǎng)、體重、肝臟重和內(nèi)臟團(tuán)重，用于計(jì)算肥滿度指數(shù)、肝臟指數(shù)和內(nèi)臟指數(shù)。取6 尾魚，使用1 mL一次性注射器自尾靜脈取血，置于4 ℃冰箱內(nèi)靜置3 h 以上，使用Eppendorf 5427 R 冷凍離心機(jī)于4 ℃、4 000 r/min 離心10 min，將分離的血清保存于-80 ℃冰箱中。取3尾魚的肝臟和背肌保存于-80 ℃冰箱中用于后續(xù)的生化分析。

飼料和魚體水分通過在105 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中持續(xù)烘干至恒重來(lái)測(cè)定；粗蛋白含量使用半自動(dòng)凱氏定氮儀（FOSS，Kjeltec 8100，丹麥）測(cè)定；粗脂肪含量使用索氏抽提法進(jìn)行測(cè)定；灰分含量采用馬弗爐灼燒法測(cè)定；飼料和肌肉氨基酸組成采用德國(guó)Sykam 氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活力使用南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒按照說(shuō)明書要求進(jìn)行測(cè)定；組織勻漿液蛋白濃度采用南京建成生物工程研究所有限公司的考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

增重率（%）=（魚體末重-魚體初重）/魚體初重×100

特定生長(zhǎng)率（%/d）=（ln 魚體末重-ln 魚體初重）×100/養(yǎng)殖天數(shù)

肝臟指數(shù)（%）=魚肝臟重/魚體末重×100

內(nèi)臟指數(shù)（%）=魚內(nèi)臟重/魚體末重×100

肥滿度（%）=魚體末重（g）/[魚末體長(zhǎng)（cm）]3×100

飼料系數(shù)=攝食飼料重/（魚體末重-魚體初重）

蛋白質(zhì)效率=（魚體末重-魚體初重）/蛋白質(zhì)攝入量

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），組間差異顯著（P＜0.05）時(shí)進(jìn)行Duncan’s 法多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料蛋氨酸水平對(duì)綠鰭?cǎi)R面鲀生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，添加0.6%蛋氨酸組魚的終末均重、增重率和特定生長(zhǎng)率顯著高于其余各組（P＜0.05），添加1.0%蛋氨酸組魚的終末體重、增重率和特定生長(zhǎng)率顯著低于其余各組（P＜0.05），添加0.4%蛋氨酸組魚的終末均重、增重率和特定生長(zhǎng)率顯著高于添加0、0.2%、0.8%和1.0%組（P＜0.05）。依據(jù)增重率與飼料蛋氨酸水平的折線模型（見圖1），得出綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚飼料中蛋氨酸的最適需求量為1.27%，占飼料粗蛋白含量的2.50%。

圖1 綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚增重率與飼料蛋氨酸水平的折線模型

表3 飼料蛋氨酸水平對(duì)綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚生長(zhǎng)性能的影響

添加0.4%和0.6%蛋氨酸組的飼料系數(shù)顯著低于其余4 組（P＜0.05），添加1.0%蛋氨酸組的飼料系數(shù)顯著高于其他各組（P＜0.05）。添加0.6%蛋氨酸組的蛋白質(zhì)效率顯著高于其余各組（P＜0.05），添加1.0%蛋氨酸組的蛋白質(zhì)效率顯著低于其他各組（P＜0.05）。

各組魚的內(nèi)臟指數(shù)和肝臟指數(shù)沒有出現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）。添加0.6%蛋氨酸組魚的肥滿度顯著高于添加0.8%和1.0%蛋氨酸組（P＜0.05）。

2.2 飼料蛋氨酸水平對(duì)綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚體組成的影響

由表4 可知，飼料中添加蛋氨酸對(duì)全魚的水分和粗灰分含量沒有顯著影響（P＞0.05）。添加0.4%和0.6%蛋氨酸組全魚的粗蛋白含量顯著高于添加1.0%蛋氨酸組（P＜0.05）。添加0.2%、0.4%和0.6%蛋氨酸組全魚的粗脂肪含量顯著低于添加0.8%蛋氨酸組（P＜0.05）。

表4 飼料蛋氨酸水平對(duì)綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚全魚體組成的影響（%，濕重）

由表5 可知，隨著飼料中蛋氨酸添加水平的升高，魚肌肉氨基酸含量總體上呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，其中添加0.4%蛋氨酸組魚肌肉的各氨基酸含量均顯著高于添加1.0%蛋氨酸組（P＜0.05），與添加0、0.2%和0.6%蛋氨酸組相比較差異不顯著。添加0.4%蛋氨酸組魚肌肉的蛋氨酸、組氨酸、精氨酸、亮氨酸、賴氨酸含量顯著高于添加0.8%蛋氨酸組（P＜0.05），與添加0、0.2%和0.6%蛋氨酸組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表5 飼料蛋氨酸水平對(duì)綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚肌肉氨基酸組成的影響（濕重，%）

2.3 飼料蛋氨酸水平對(duì)綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚血清與肝臟酶活力的影響

由表6可知，添加0.6%蛋氨酸組魚血清過氧化氫酶活力顯著高于添加0.2%、0.8%和1.0%蛋氨酸組（P＜0.05）；血清溶菌酶活力顯著高于添加0、0.2%、0.8%和1.0%蛋氨酸組（P＜0.05）。添加0.4%、0.6%蛋氨酸組魚血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活力顯著低于添加0、0.2%和1.0%蛋氨酸組（P＜0.05）。

表6 飼料蛋氨酸水平對(duì)綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚血清和肝臟酶活力的影響

添加0.6%蛋氨酸組魚肝臟過氧化氫酶活力顯著高于其余各組（P＜0.05），不添加組和添加1.0%蛋氨酸組魚肝臟過氧化氫酶活力顯著降低。各組間肝臟超氧化物歧化酶活力沒有顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 飼料蛋氨酸水平對(duì)綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚生長(zhǎng)性能的影響

蛋白質(zhì)是水生動(dòng)物機(jī)體的主要組分，也是水產(chǎn)飼料的主要營(yíng)養(yǎng)成分。研究表明，水生動(dòng)物生長(zhǎng)需要十種必需氨基酸，其對(duì)飼料蛋白質(zhì)的需求本質(zhì)上是對(duì)必需氨基酸的需求，蛋氨酸作為容易缺乏的必需氨基酸之一，對(duì)水生動(dòng)物的生長(zhǎng)性能有著顯著的影響[17]。通常，當(dāng)?shù)鞍彼釘z入量不足時(shí)會(huì)降低水生動(dòng)物的生長(zhǎng)速度，在低魚粉飼料中補(bǔ)充晶體蛋氨酸可以改善其生長(zhǎng)性能[18]。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了一個(gè)低魚粉基礎(chǔ)飼料配方，補(bǔ)充了除蛋氨酸以外的其他必需氨基酸，在不補(bǔ)充蛋氨酸的情況下，綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚的生長(zhǎng)速度明顯減慢，補(bǔ)充適量的DL-蛋氨酸明顯提高了魚的生長(zhǎng)速度，這說(shuō)明在達(dá)到最適需求量前，飼料中的蛋氨酸含量是不足的，補(bǔ)充蛋氨酸提高了飼料必需氨基酸的平衡性，進(jìn)而改善了魚的生長(zhǎng)性能。在珍珠龍膽石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）[7]、革胡子鲇（Clarias gariepinus）[8]、大黃魚（Pseudosciaena crocea）[19]、許氏平鮋（Sebastes schlegeli）[20]、卵形鯧鲹（Trachinotus blochii）[21]等魚類上也有相同的報(bào)道。然而，在達(dá)到最適需求量后，再提高DL-蛋氨酸的添加量，發(fā)現(xiàn)過量的晶體蛋氨酸不僅不能進(jìn)一步提高綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚的生長(zhǎng)性能，反而顯著降低了魚的生長(zhǎng)速度，這說(shuō)明過量的蛋氨酸不僅增加了魚體內(nèi)的脫氨作用[22]，而且導(dǎo)致體內(nèi)的S-腺苷蛋氨酸積累，造成高蛋氨酸血癥，進(jìn)而引起毒性作用[23]。因此，本試驗(yàn)中綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚的增重率與飼料蛋氨酸水平之間的相關(guān)性符合折線模型，分析得出綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚飼料中的蛋氨酸最適需求量為1.27%，占飼料粗蛋白的2.50%。 這與軍曹魚（Rachycentron canadum）（2.64%）[24]、許氏平鮋（S.schlegeli）（2.80%）[20]、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）（2.47%～2.50%）[25]和斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）（2.73%）[17]飼料的最適蛋氨酸需求量接近，低于大黃魚（P.crocea）（3.22%～3.34%）[19]和黑鯛（Sparus macrocephalus）（4.50%～4.53%）[26]，高于革胡子鲇（C.gariepinus）（1.87%～2.14%）[8]和鯉魚（Cyprinus carpio）（2.13%）[27]，不同魚種間飼料蛋氨酸需求量的差異與魚的品種、規(guī)格、養(yǎng)殖條件（包括投喂模式、水溫、養(yǎng)殖密度等）等因素有關(guān)。

與生長(zhǎng)性能表現(xiàn)的變化趨勢(shì)一樣，在飼料蛋氨酸含量達(dá)到最適需求量前，補(bǔ)充DL-蛋氨酸彌補(bǔ)了飼料蛋氨酸不足的問題，提高了必需氨基酸的平衡性，從而降低了飼料系數(shù)，提高了蛋白質(zhì)效率，表明在綠鰭?cǎi)R面鲀低魚粉飼料中補(bǔ)充晶體蛋氨酸是有效的，可以起到改善飼料利用率的作用。在石斑魚[4]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[28]等魚類上也有相同的結(jié)果。然而，與不補(bǔ)充DL-蛋氨酸相比較，過量添加DL-蛋氨酸明顯提高了飼料系數(shù)，降低了蛋白質(zhì)效率，這與大黃魚（P.crocea）[19]、錦鯉（Cyprinus carpio haematopterus）[29]和羅非魚（Oreochromis niloticus）[30]上的研究結(jié)果相一致，表明過量補(bǔ)充蛋氨酸會(huì)起到負(fù)面作用[23]。

蛋氨酸是魚體蛋白質(zhì)合成的必需氨基酸[26]。本試驗(yàn)中，在達(dá)到最適需求量前，全魚粗蛋白含量和肌肉氨基酸組成未表現(xiàn)出顯著的差異。然而，過高的蛋氨酸明顯限制了魚體蛋白質(zhì)的合成，降低了肌肉氨基酸含量[31-32]。與粗蛋白的變化趨勢(shì)相反，隨著蛋氨酸水平的升高，綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚的粗脂肪含量呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，在團(tuán)頭魴（M.amblycephala）[25]和南亞野鯪（Labeo rohita）[33]上也有類似的結(jié)果。在低蛋氨酸水平下，魚更傾向于使用蛋白質(zhì)而非脂肪作為能量物質(zhì)，導(dǎo)致體脂肪沉積，隨著蛋氨酸水平的升高，蛋白質(zhì)更多用于合成體蛋白，同時(shí)脂質(zhì)沉積減少[8,25,33-34]。而過高的蛋氨酸限制了蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致多余的氨基酸被用作能量，并為脂質(zhì)合成提供了碳骨架，造成體脂沉積[25]。

3.2 飼料蛋氨酸水平對(duì)綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚生理生化指標(biāo)的影響

溶菌酶具有破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的功能，其活力與殺滅細(xì)菌的能力有密切聯(lián)系[35]，血清中溶菌酶活力的相對(duì)增加能夠反映出魚體免疫功能的增強(qiáng)[36]。本試驗(yàn)中，飼料蛋氨酸水平對(duì)血清中的溶菌酶具有顯著影響，在達(dá)到最適需求量前，溶菌酶活力隨著蛋氨酸水平的升高而顯著提高。在建鯉（Cyprinus carpiovar.Jian）[37]和羅非魚（O.niloticus）[38]的研究中，也發(fā)現(xiàn)飼料中補(bǔ)充蛋氨酸能夠通過增加血清中溶菌酶活力起到免疫調(diào)節(jié)的作用，表明其可以提高抑菌以及殺菌能力。谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶是氨基酸代謝的關(guān)鍵酶，能夠反映出氨基酸的代謝強(qiáng)度[39]。當(dāng)肝臟功能受限時(shí)，肝臟細(xì)胞會(huì)釋放出更多的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶到血液中[40]。本試驗(yàn)中，添加適量蛋氨酸降低了血清中轉(zhuǎn)氨酶的活力，在金鯧魚[41]、黃顙魚[42]和大黃魚[43]中都得到了類似的結(jié)果，表明適量的蛋氨酸有利于肝臟代謝，缺乏和過量都會(huì)對(duì)肝臟代謝產(chǎn)生不利影響。

在抗氧化系統(tǒng)中蛋氨酸也發(fā)揮著重要的作用[44]。在正常的機(jī)體代謝中，活性氧的產(chǎn)生和消除維持著一種穩(wěn)態(tài)，當(dāng)穩(wěn)態(tài)被打破時(shí)，便會(huì)引起機(jī)體的氧化損傷，抗氧化防御系統(tǒng)可以減輕活性氧對(duì)機(jī)體造成的氧化損傷[45]?？寡趸溉绯趸锲缁浮⒐入赘孰倪^氧化酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和過氧化氫酶，可以清除多余的破壞性活性氧，從而減少脂質(zhì)過氧化損傷并在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[46]。在雜交鱸[47-48]上的研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加蛋氨酸能夠顯著提高肝臟中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，降低魚體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化。蛋氨酸還可使建鯉（C.carpiovar.Jian）頭腎和脾臟中的谷胱甘肽還原酶活性、脾臟中的抗氧化自由基及過氧化氫酶活性顯著增加，顯著降低丙二醛含量，明顯提高建鯉的抗氧化能力[49]。在本試驗(yàn)中，最適蛋氨酸水平顯著提高了綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚血清和肝臟中的過氧化氫酶活力，表明適量補(bǔ)充蛋氨酸能夠提高綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚的抗氧化能力，減輕氧化損傷。

4 結(jié)論

飼料中補(bǔ)充適量的DL-蛋氨酸能夠提高綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚的生長(zhǎng)性能，降低飼料系數(shù)，提高蛋白質(zhì)效率，蛋氨酸過量會(huì)降低魚的生長(zhǎng)速度，降低飼料利用率。依據(jù)增重率與飼料蛋氨酸水平的折線模型分析，得出綠鰭?cǎi)R面鲀幼魚飼料中蛋氨酸的最適需求量為1.27%，占飼料粗蛋白含量的2.50%。