韓　偉　丁伯良　王英珍　張　莉

摘要:從天津市郊縣某豬場發(fā)病仔豬腦中分離到一株病毒。該病毒接種雞胚絨毛尿囊膜有白色的痘斑出現(xiàn),接種PK-15和BHK-21細胞出現(xiàn)典型的細胞病變,毒價(TCID50)為10-6/mL,且能被PRV陽性血清中和;將病毒給家兔注射后出現(xiàn)典型的偽狂犬病癥狀并導致死亡。通過上述試驗結(jié)果證明,該分離毒株為偽狂犬病毒。

關(guān)鍵詞:豬;偽狂犬病毒;分離;鑒定

中圖分類號:S858.28文獻標識碼:ADOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.03.002

Isolation and Identification of Swine Pseudorabies Virus

HAN Wei,DING Bo-liang,WANG Ying-zhen,ZHANG Li

(Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Tianjin 300112,China)

Abstract:One virus was isolated from brain organ of diseased pig which came from a pig farm in Tianjin. After inoculating the virus,the white spots could be seen in chick embryo chorioallantoic membrane, and typical cytopathogenic effect(CPE)appeared in PK-15 and BHK-21 cells. TCID50 of the virus was 10-6/mL.The virus could be neutralized by standard positive serum of pseudorabies virus. After injecting the virus, rabbits showed typical pseudorabies clinical symptom and died. By the above experiment results, the isolated virus was identified as PRV.

Key words: pig;pseudorabies virus;isolation;identification

偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV) 引起的一種高度接觸性、急性傳染病。該病毒可引起多種家畜和野生動物發(fā)病,豬是該病原的傳播者和自然宿主。臨床表現(xiàn)為新生仔豬發(fā)熱、腹瀉和神經(jīng)癥狀;母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙癥[1,2]。本病流行已給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失,嚴重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。近年來,天津地區(qū)豬場也時有該病的發(fā)生,筆者從天津某發(fā)病豬群分離到一株病毒,經(jīng)試驗鑒定為豬偽狂犬病病毒。

1材料和方法

1.1材 料

病料:腦組織采自天津郊縣某豬場發(fā)病仔豬。

細胞與培養(yǎng)基:PK-15、BHK-21細胞由本實驗室保存并提供;MEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司;新生牛血清購自北京民海生物公司。

雞胚及試驗動物:種蛋購自天津市某種雞場,在本室孵化至10日齡后使用,試驗用兔購自天津西青某養(yǎng)殖場。

PRV標準毒株及陽性血清:PRV閩A株由本實驗室保存,PRV陽性血清由本實驗室制備。

PCR引物:按文獻[3]的引物設計合成,預期產(chǎn)物178 bp。

PRV( gE)U3:4655'ATGGGCATCGCCGACTACCT3'

PRV( gE)L3:6425'CCACCGCCACAAAGAACACG 3'

1.2方 法

1.2.1病毒分離[4,5]取病仔豬腦加入5倍量Hanks液(pH7.0,內(nèi)含青、鏈霉素各1 000 U/mL),研磨成勻槳,4 ℃過夜處理后4 000 r/min離心30 min,取上清液接種PK-15和BHK-21細胞,37 ℃作用1 h,期間每隔20 min搖晃一次,作用完畢棄去接種物,加入含有2%新生牛血清的MEM維持液,并設空白對照和陽性對照(PRV閩A株)。每日觀察2次,觀察5 d,當接種細胞出現(xiàn)細胞病變(CPE),并達到80%以上病變時收獲傳代,分離病毒株并連續(xù)傳至F7代,以適應細胞生長。

1.2.2毒價測定[6]取分離病毒株的F7代毒株作10倍系列稀釋(10-1～10-10),接種于已長成單層的PK-15細胞96孔細胞板,每個稀釋度接種8孔,每孔接種0.1 mL,第11、12 列為2%新生牛血清的MEM維持液做空白對照。連續(xù)觀察7 d,記錄各個梯度的病變數(shù),按Reed-Muench 法計算分離毒株的病毒半數(shù)細胞感染量(TCID50)。

1.2.3中和試驗[6]用固定病毒稀釋血清法。將PRV陽性血清分別進行2倍、3倍、5倍稀釋,再加入等量體積并稀釋至200個TCID50分離毒株,37 ℃作用1 h,每個稀釋度做4次重復,分別接種于已長成單層的PK-15細胞板,設維持液空白對照和PRV閩A株陽性對照,連續(xù)觀察5 d,記錄各個稀釋度的細胞病變數(shù)。

1.2.4雞胚絨毛尿囊膜接種[6]將上述的分離毒株培養(yǎng)物接種于3枚10日齡雞胚絨毛尿囊膜,每枚接種0.2 mL,并同時設同劑量的2%新生牛血清的MEM維持液接種雞胚作為對照,37 ℃孵化144 h,每日照蛋2次。棄去24 h死亡的雞胚,觀察24 ~144 h死亡和未死亡的雞胚絨毛尿囊膜是否有痘斑形成。

1.2.5PCR鑒定按文獻[3] 應用特異性引物進行PCR擴增,最后進行瓊脂糖凝膠電泳,觀察PCR擴增結(jié)果。

1.2.6動物實驗[7]取分離病毒株的F7代毒株接種3只家兔頸部皮下,每只注射1 mL,空白對照家兔接種同劑量的MEM維持液,兩個試驗組分開飼養(yǎng)14 d,每天觀察家兔的采食、體溫、精神狀態(tài)等情況。

2結(jié)果與分析

2.1病毒分離

病料接種PK-15細胞后,F2代觀察到CPE。接種細胞后48 h鏡檢,可見細胞拉長、變圓,為特征性病變,至72 h可見細胞脫落,參見圖1,2。其分離毒株在BHK-21細胞傳代,病變?yōu)榧毎L、變圓、形成巨細胞,參見圖3,4。其細胞病變同PRV閩A株的病變一致。

2.2病毒毒價測定

分離毒株的TCID50為10-6/mL。

2.3中和試驗

PRV陽性血清與分離毒株中和的結(jié)果見表1。表1表明,陽性血清稀釋2倍、3倍時沒有出現(xiàn)細胞病變,陽性血清5倍稀釋時出現(xiàn)細胞病變。PRV閩A陽性對照株均未出現(xiàn)細胞病變,結(jié)果表明,已知PRV陽性血清能中和分離毒株與PRV閩A株在細胞上的病變,但存在一些差異。

2.4雞胚絨毛尿囊膜接種

分離株接種后144 h,雞胚均未死亡,4 ℃凍胚4 h后觀察病變,可見雞胚絨毛尿囊膜水腫、增厚并有白色的痘斑,對照雞胚絨毛尿囊膜無異常病變(圖5)。

2.5PCR鑒定

分離毒擴增出預期的PCR產(chǎn)物,PCR檢測陽性(圖6)。

2.6動物試驗結(jié)果

接種分離的病毒懸液的家兔,注射后3 d表現(xiàn)為奇癢,用嘴啃咬注射部位,使注射部位被毛脫落,皮膚受損,繼而死亡。而注射MEM維持液的對照家兔無異常變化。

3討 論

(1)本試驗通過細胞培養(yǎng)分離病毒、雞胚絨毛尿囊膜接種、動物接種試驗、中和試驗和PCR鑒定,證明該病毒為豬偽狂犬病毒,將新分離的病毒命名為TJ-1株。

(2)PRV為皰疹病毒屬病毒,能夠在雞胚絨毛尿囊膜上形成明顯的痘斑,家兔攻毒后出現(xiàn)典型的瘙癢癥狀,這兩種方法操作簡便,結(jié)果容易分辨,對于沒有細胞培養(yǎng)條件的實驗室可以作為一種有效的初步鑒定方法。

(3)偽狂犬病只有在仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,而母豬繁殖障礙的臨床表現(xiàn)又與豬瘟、細小病毒、乙腦和豬呼吸與繁殖障礙綜合征癥狀類似時發(fā)生,鑒別診斷比較困難,通過實驗室的病原分離可以做出正確的診斷。在國內(nèi)應推行PRV基因缺失疫苗免疫預防,再進行相應的鑒別診斷淘汰陽性豬,凈化豬群,進而根除偽狂犬病,提高我國養(yǎng)豬業(yè)的水平。

參考文獻:

[1] 蔡寶祥.家畜傳染病學(第4版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2001:207-209.

[2] 斯特勞,阿萊爾,蒙加林,等. 豬病學(第8版)[M].趙德明,張中秋,沈建中,譯.北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社,2000:238-253.

[3] 張莉,丁伯良,王英珍,等.區(qū)分豬偽狂犬病毒gE缺失疫苗株和野毒株的gE-PCR方法的建立[J].動物醫(yī)學進展,2008,29(11):5-8.

[4] 陳煥春,方六榮,何啟蓋,等.豬偽狂犬病病毒鄂A株的分離鑒定[J].畜牧獸醫(yī)學報,1998,29(2):97-104.

[5] 黃偉堅,溫榮輝,秦愛珍,等. 豬偽狂犬病病毒桂W株的分離鑒定[J].中國預防獸醫(yī)學報,2000,22(4):241-243.

[6] 殷震,劉景華. 動物病毒學(第2版)[M].北京:科學出版社,1997:329-340,998-1009.

[7] 楊潤德,郁宏偉,張洪德,等.豬偽狂犬病病毒的分離鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志,2008,44(1):25-26.