胡寶剛　劉　莉　焦定量

摘要：抑制消減雜交(SSH)是一種適用于分離2個(gè)遺傳背景相關(guān)的樣品之間差異表達(dá)基因的技術(shù)，目前該技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用不是很多。文章主要綜述了抑制消減雜交技術(shù)在瓜菜類(lèi)作物不同發(fā)育階段和抗病、逆境脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因以及其他相關(guān)差異基因研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀。

關(guān)鍵詞：抑制消減雜交；差異表達(dá)基因；瓜菜；抗病；逆境脅迫

隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展以及部分生物的基因組全序列測(cè)序的陸續(xù)完成．生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)已經(jīng)從結(jié)構(gòu)基因組研究轉(zhuǎn)向基因功能及表達(dá)調(diào)控的功能基因組研究。因此．大量基因克隆的新技術(shù)也不斷涌現(xiàn)．其中以1992年Liang等提出的mRNA差異顯示技術(shù)(mRNA differential display re—verse transcription PCR．DDRT-PCR)，1994年Hubank等提出的代表性差別分析(representational diffefence analysis．RDA)技術(shù)．1996年Diatehenko等提出的抑制消減雜交(suppression subtractive hybriion，SSH)技術(shù)及1998年Kang等提出的交互差減RNA差別顯示技術(shù)(reciprocalsubtraction differential RNA display，RSDD)為代表。

抑制消減雜交(SSH)技術(shù)是一種能高效快速克隆差異表達(dá)基因的新技術(shù)．該技術(shù)是Diatehenko等在抑制PCR(sup-pression polymerase chain reaction)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的篩選差異表達(dá)基因的方法．通過(guò)該技術(shù)人們可以比較同一細(xì)胞或組織在不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段或不同的生理?xiàng)l件下基因表達(dá)的差異，并富集、分離、克隆出這些差異表達(dá)基因進(jìn)行功能研究。ssH起初多應(yīng)用在動(dòng)物(包括人類(lèi))等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而在植物研究領(lǐng)域尤其是瓜菜作物研究中只得到初步應(yīng)用。在瓜菜作物上應(yīng)用該技術(shù)．通過(guò)分離克隆相關(guān)差異表達(dá)基因可以為分析其生長(zhǎng)發(fā)育和抗病、抗逆性規(guī)律，闡明作用機(jī)理提供重要的信息基礎(chǔ)。本文在介紹SSH技術(shù)原理及特點(diǎn)的同時(shí)．著重總結(jié)其在瓜類(lèi)和蔬菜作物研究上的應(yīng)用進(jìn)展情況。

1抑制消減雜交技術(shù)

1．1基本原理

抑制消減雜交(SSH)主要基于抑制性PCR與eDNA消減雜交(subwaefive hybridization)技術(shù)。所謂抑制性PCR就是通過(guò)利用含引物序列的雙鏈接頭(adaptor)，使非目的片段兩端接上同一接頭．該接頭具有反向末端重復(fù)序列，在退火時(shí)鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火．使非目的序列片段產(chǎn)生類(lèi)似“鍋柄”的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)．在PCR時(shí)無(wú)法與引物配對(duì)．從而選擇性抑制非目的序列的擴(kuò)增。SSH的消減富集則運(yùn)用了雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理．即高豐度單鏈在退火時(shí)雜交形成雙鏈的速度快于低豐度單鏈．從而使原來(lái)在豐度上有差別的單鏈相對(duì)含量達(dá)到基本一致．即低豐度差異表達(dá)的基因不會(huì)丟失．而高豐度差異表達(dá)的基因又不會(huì)被過(guò)量分離。

SSH基本過(guò)程：(1)提取2種差異細(xì)胞或組織的mRNA，其中包含差異表達(dá)基因的為檢測(cè)組(Tester)，另1組為驅(qū)動(dòng)組(Driver)，分別反轉(zhuǎn)錄合成eDNA，并用限制性?xún)?nèi)切酶Rsa I酶切為平頭末端dscDNA片段。(2)將酶切后的Tester eDNA分為2份，1份與接頭l(adaptorl)連接．另1份與接頭2R(adaptor2R)連接．接頭3端與eDNA片段5端連接。接頭外側(cè)序列(圖l中接頭黑色部分)與第1次PCR引物(PCR primerl)相同，而接頭內(nèi)側(cè)序列分別與第2次PCR2個(gè)引物(nested primerl和nestedprimer2R)相同。(3)分別向連接不同接頭的TestercDNA中加入過(guò)量Driver eDNA．進(jìn)行第l輪雜交．得到4種產(chǎn)物：a為差異表達(dá)的單鏈tester eDNA~b為自身退火的TestereDNA；e為異源退火Tester／Driver eDNA(共有序列形成異源雜交產(chǎn)物)：d為自身退火的Driver cDNA。第2輪雜交時(shí)．將第1次2份雜交產(chǎn)物在新鮮變性DrivereDNA存在的條件下混合雜交，進(jìn)一步去除共有序列．雜交完畢產(chǎn)物中形成一種特殊類(lèi)型的e型分子．它是檢測(cè)組中含有的而驅(qū)動(dòng)組中沒(méi)有的eDNA片段．由第1輪雜交中形成的連接有不同接頭a片段退火形成。(4)2次選擇性PCR擴(kuò)增：第2輪雜交后補(bǔ)平接頭．第1次PCR擴(kuò)增時(shí)引物為PCRprimer 1．a(chǎn)、d型分子無(wú)引物結(jié)合位點(diǎn)不能擴(kuò)增：c型分子為單接頭，只能線性擴(kuò)增Ib型分子兩端接頭相同。由于接頭上有退火溫度很高的反向重復(fù)序列．形成“鍋柄”結(jié)構(gòu)．受抑制PCR效應(yīng)。故不能被擴(kuò)增。只有目標(biāo)片段形成的e型分子兩端連有不同接頭。以指數(shù)級(jí)大量擴(kuò)增。第2次PCR擴(kuò)增時(shí)。換用接頭內(nèi)側(cè)引物(nested primerl和nested primer 2R)進(jìn)一步選擇性擴(kuò)增目標(biāo)片段。經(jīng)過(guò)2輪消減雜交和2輪選擇性PCR．目標(biāo)片段已被大大富集．其產(chǎn)物可以直接用于克隆構(gòu)建消減文庫(kù)。

1．2特點(diǎn)

SSH技術(shù)操作流程比較簡(jiǎn)單、周期短．且有市售的試劑盒可供利用．技術(shù)難度不大；該技術(shù)方法可以使低豐度的mRNA得到高于1000倍的富集．靈敏度高．較適于在轉(zhuǎn)錄水平上研究生物基因的差異表達(dá)：1次SSH反應(yīng)可同時(shí)分離上百至上千個(gè)差異表達(dá)的基因片段．適用于大規(guī)模的基因表達(dá)分析。效率高且假陽(yáng)性率低。但SSH技術(shù)仍有它的不足之處，如所需的起始mRNA量較大(一般為幾u(yù)g)，如果mRNA量不夠．2次差減后有些關(guān)鍵的、低豐度表達(dá)的差異eDNA片段可能檢測(cè)不到．而且SSH獲得的eDNA片段一般較短。要想獲得全長(zhǎng)序列就要用這些基因片段作為探針從eDNA文庫(kù)中篩出全長(zhǎng)基因。

2抑制消減雜交技術(shù)在瓜菜作物研究中的應(yīng)用

目前SSH技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域已有成功的報(bào)道．國(guó)內(nèi)外學(xué)者已成功將SSH技術(shù)運(yùn)用于研究機(jī)體各種疾病相關(guān)基因表達(dá)、免疫細(xì)胞和組織的基因調(diào)控、腫瘤相關(guān)基因以及某些耐藥性基因的克隆等方面。實(shí)踐證明，SSH技術(shù)也特別適合于研究植物發(fā)育階段轉(zhuǎn)型前后、個(gè)體內(nèi)不同器官之間以及受環(huán)境因子影響較大的差異表達(dá)基因的克隆。

2．1在瓜菜作物發(fā)育生物學(xué)中的應(yīng)用

植物體內(nèi)大部分基因都是時(shí)空表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)的．在植體內(nèi)的不同發(fā)育時(shí)期、不同組織器官基因的表達(dá)不同。研究不同發(fā)育階段、不同組織器官基因的差異表達(dá)．對(duì)于研究瓜菜類(lèi)作物的生長(zhǎng)、發(fā)育和衰老等規(guī)律并應(yīng)用到實(shí)踐育種中具有重要的意義。

肖鋼等以授粉后27 d的種子mRNA為檢測(cè)組．授粉后7 d的種子mRNA為驅(qū)動(dòng)組利用SSH技術(shù)構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜種子發(fā)育期基因差異表達(dá)文庫(kù)，得到560個(gè)克?。畬?duì)456個(gè)PCR陽(yáng)性克隆進(jìn)行斑點(diǎn)雜交．得到201個(gè)上調(diào)的陽(yáng)性斑點(diǎn)雜交克隆，測(cè)序得到有效ESTs序列198個(gè)。BLASTN結(jié)果顯

示，134個(gè)ESTs可能是新基因．另外64個(gè)ESTs序列在油菜或擬南芥核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中存在同源序列．這64個(gè)ESTs序列和編碼已知功能蛋白(主要是能量代謝、物質(zhì)代謝、基因調(diào)控、衰老及抗性等)的基因有高度相似性．馬春泉等㈣利用SSH技術(shù)構(gòu)建了甜菜M14品系在花期的ZAP表達(dá)載體的eDNA文庫(kù)．獲得的M14品系特異表達(dá)的2個(gè)EST片段即eDNAMe286和Me284；采用RACE技術(shù)獲得了基因M14286 cDNA片段的全長(zhǎng)序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)M14品系特異表達(dá)基因M14286的eDNA片段與eDNA片段Me284分別與大花馬齒莧(Portulaca grandilrIora)及瓶子草(Sarracenlapurpurea)的26S核糖體RNA具有很高的同源性。

周增光等以矮化突變的甘藍(lán)型油菜莖尖為檢測(cè)組．野生型莖尖為驅(qū)動(dòng)組．通過(guò)SSH構(gòu)建了與植株高矮性狀關(guān)系最密切的莖尖差異表達(dá)eDNA差減文庫(kù)．利用反向消減cDNA文庫(kù)斑點(diǎn)印跡篩選得到30個(gè)陽(yáng)性克?。蛄袦y(cè)定和同源性比對(duì)分析表明，所得克隆的功能涉及第2信使、轉(zhuǎn)錄因子、激素代謝、蛋白質(zhì)降解及轉(zhuǎn)運(yùn)等多個(gè)方面．為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)油菜植株矮化機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。Park等通過(guò)SSH技術(shù)構(gòu)建了綠色和紅色萵苣(生菜)葉片的差減文庫(kù)，利用no．hem雜交技術(shù)檢測(cè)到566個(gè)克隆中有53個(gè)在紅葉片中過(guò)量表達(dá)．其中6個(gè)上調(diào)基因中CHS、F3H和DFR基因的表達(dá)與紫外線照射下萵苣葉片中花青素的積累正相關(guān)．這對(duì)進(jìn)一步研究蔬菜作物的次級(jí)代謝提供了有價(jià)值的資源。Zhou等通過(guò)SSH和RT-PCR技術(shù)研究了甘藍(lán)型油菜無(wú)瓣花突變體Apet 33-10的花器官形態(tài)發(fā)生和差異表達(dá)基因．發(fā)現(xiàn)在花器官形成過(guò)程中不能觀測(cè)到花瓣原基而其他器官形成正常．在Apet 33-10早期花芽分化中有18個(gè)基因表達(dá)下調(diào)．這些基因與包括花瓣特異表達(dá)．鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，mRNA加工。蛋白合成與降解，細(xì)胞骨架構(gòu)建．核酸結(jié)合和生物堿的合成等相關(guān)。Terefe等以黃瓜兩性花花芽eDNA為檢測(cè)組．以雌株花芽eDNA為驅(qū)動(dòng)組．通過(guò)抑制消減雜交得到了178個(gè)eDNA克隆。其中選出21個(gè)做點(diǎn)雜交發(fā)現(xiàn)有11個(gè)克隆是僅在黃瓜兩性花花芽中表達(dá)的、10個(gè)是雌株花芽中差異表達(dá)的。為進(jìn)一步分離決定花性型的基因提供了基礎(chǔ)。植物花性型的分化是一個(gè)高度復(fù)雜的、在一定遺傳背景控制下的生理生化及形態(tài)發(fā)生過(guò)程．瓜類(lèi)不同花性型的研究一直以來(lái)都是育種研究的重點(diǎn)．用SSH技術(shù)分離相關(guān)的誘導(dǎo)表達(dá)型基因和不同花性型差異表達(dá)基因．揭示瓜類(lèi)作物花性型分化的分子機(jī)制．對(duì)于其育種工作具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。

2．2在瓜菜抗病蟲(chóng)研究中的應(yīng)用

病蟲(chóng)害的發(fā)生是影響瓜菜作物高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的重要因素．探索瓜菜作物抗病、抗蟲(chóng)基因作用的分子機(jī)制是開(kāi)展和實(shí)施瓜菜基因工程的重要基礎(chǔ)．SSH技術(shù)的應(yīng)用無(wú)疑為這類(lèi)研究提供了一種很有效的工具。

Kirankamar等㈣從SSH文庫(kù)中分離到600個(gè)Pro基因在番茄里過(guò)量表達(dá)而可能產(chǎn)生的特異基因．然后結(jié)合微陣列技術(shù)分析了Pro過(guò)量表達(dá)的抗性株與感病株在接種番茄葉霉菌后的不同時(shí)間里這些基因的表達(dá)譜．最終鑒定出223個(gè)Pro過(guò)量表達(dá)的特異應(yīng)答基因。茆振川等以含Ⅳ基因的辣椒為試驗(yàn)材料，接種南方根結(jié)線蟲(chóng)12、24、36 h的根尖材料作為檢測(cè)組，相應(yīng)的未接種的根尖材料作為驅(qū)動(dòng)組．構(gòu)建1個(gè)南方根結(jié)線蟲(chóng)誘導(dǎo)Ⅳ基因表達(dá)早期的正向抑制消減雜交eDNA文庫(kù)，并結(jié)合文庫(kù)高密度點(diǎn)陣膜雜交差異篩選．獲得237個(gè)ESTs，在GenBank上進(jìn)行比對(duì)分析得到148個(gè)功能已知的EST序列，獲得68個(gè)已知的表達(dá)上調(diào)的抗性相關(guān)ESTs．分離出了具有NBS-LRR結(jié)構(gòu)的抗線蟲(chóng)蛋白和類(lèi)LRR抗性蛋白的基因，防御作用相關(guān)的類(lèi)萌芽素(GLP)、HSR203J蛋白、蜜腺蛋白、蛇毒素肽等基因，抗性相關(guān)的WRKY、ERFBP等轉(zhuǎn)錄因子基因，以及G蛋白、14-3-3蛋白等多種信號(hào)蛋白基因．為了解抗線蟲(chóng)機(jī)制提供了依據(jù)。

Xu等利用SSH技術(shù)構(gòu)建了尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)西瓜根的消減文庫(kù)．共得到562個(gè)高質(zhì)量的ESTs．經(jīng)過(guò)功能注釋后發(fā)現(xiàn)，最普遍的一類(lèi)EST序列是與病害和防御相關(guān)的，約占33．5％．其次是與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用相關(guān)的EST序列約占13．1％．序列分析認(rèn)為系統(tǒng)自身獲得性抗病是西瓜對(duì)尖孢鐮刀菌產(chǎn)生抗性的主要原因。趙熙等_1句成功利用SSH技術(shù)構(gòu)建了富集大白菜干燒心病的相關(guān)基因的消減cDNA文庫(kù)．采用PCR方法對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行了重組子鑒定．共得到831個(gè)重組子．該文-庫(kù)的構(gòu)建成功地為深入研究大白菜干燒心發(fā)病后基因的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)．為進(jìn)一步探討研究大白菜干燒心病的致病機(jī)理提供了參考。

2．3在逆境脅迫下差異表達(dá)基因研究中的應(yīng)用

植物在不同的逆境條件下會(huì)表現(xiàn)出具有一定的抗性．分析不同逆境脅迫下的差異表達(dá)基因及分離克隆差異表達(dá)基因并進(jìn)行功能分析．有助于闡明逆境調(diào)控通路．對(duì)進(jìn)一步揭示逆境脅迫的分子調(diào)控途徑具有重要的作用．

Maya等利用SSH和cDNA-AFLP技術(shù)研究鑒定了氟樂(lè)靈除草劑誘導(dǎo)甜瓜抗鐮刀菌枯萎病．消減文庫(kù)得到共123個(gè)克隆。經(jīng)過(guò)測(cè)序分析，其中60個(gè)為未知基因，35％的克隆為已經(jīng)報(bào)道的與脅迫、防御相關(guān)的基因．隨機(jī)挑選32個(gè)克隆進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：當(dāng)用氟樂(lè)靈處理時(shí)1／3的基因上調(diào)．而甜瓜植株用高鹽處理時(shí)有4個(gè)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)增強(qiáng)．說(shuō)明氟樂(lè)靈能夠誘導(dǎo)植株的脅迫應(yīng)答反應(yīng)．從而保護(hù)植株防衛(wèi)鐮刀菌枯萎病。解莉楠等以鹽堿脅迫下的羊草地上部分cDNA為檢測(cè)組．非鹽堿條件下生長(zhǎng)的羊草地上部分cDNA為驅(qū)動(dòng)組，利用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建了鹽堿脅迫下羊草消減文庫(kù)，篩選出1920個(gè)陽(yáng)性克?。畬⒌玫降?52個(gè)非重復(fù)序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)．其中有548個(gè)與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列有同源性，其中功能已知的339個(gè)．功能未知序列209個(gè)，獲得了與鹽堿脅迫相關(guān)的基因．為抗逆基因的克隆及系統(tǒng)研究鹽堿脅迫下羊草相關(guān)基因的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。Mi等通過(guò)抑制消減雜交技術(shù)分離鑒定了黃瓜的低光照誘導(dǎo)的基因，以100 txmol／m2·s處理的幼苗eDNA為檢測(cè)組．800Ixm01／m2-s處理的幼苗cDNA為驅(qū)動(dòng)組構(gòu)建了消減eDNA文庫(kù)，得到768個(gè)重組子克隆，其中246個(gè)為低光照誘導(dǎo)克?。?jīng)過(guò)測(cè)序比對(duì)64個(gè)ESTs中有50個(gè)在GenneBank中能夠找到同源序列，14個(gè)ESTs為分離得到的新基因。Thay等利用SSH技術(shù)從6度處理48 h的玉米幼苗中分離鑒定一些新的基因．這些冷凍誘導(dǎo)基因與起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和光合作用調(diào)節(jié)的已知蛋白功能近似。通過(guò)RT-PCR選出1組基因分別命名為：ZmC016．ZmACAI，ZmDREB2A和ZmERF3，證實(shí)這些基因都是低溫逆境脅迫下表達(dá)的。SSH技術(shù)在植物逆境脅迫基因的克隆中成功應(yīng)用．為更深入利用該技術(shù)分離瓜菜作物抗性基因提供了重要的方法指導(dǎo)。

3結(jié)語(yǔ)

當(dāng)前將瓜菜作物研究的重點(diǎn)一直放在育種工作中。而抗病蟲(chóng)性和抗逆性一直是重要的育種目標(biāo)．但由于對(duì)相當(dāng)部分病蟲(chóng)脅迫機(jī)制并不清楚．發(fā)揮抗性的主效或?qū)Ｒ换蛐枰M(jìn)一步明確．啟動(dòng)抗性反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等問(wèn)題需要進(jìn)行深入的研究。SSH技術(shù)的出現(xiàn)和成熟無(wú)疑將成為瓜菜作物差異基因表達(dá)研究的強(qiáng)有力工具。利用該技術(shù)可以廣泛地開(kāi)啟各種病蟲(chóng)脅迫、逆境脅迫條件下的基因差異表達(dá)的研究．深入了解抗病蟲(chóng)的機(jī)理機(jī)制．將為優(yōu)良品種的選育提供理論依據(jù)和資源。

雖然SSH技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于部分瓜菜作物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的差異表達(dá)基因、抗病蟲(chóng)特異表達(dá)基因、逆境脅迫條件下差異表達(dá)基因以及其他相關(guān)基因的研究中。但應(yīng)用范圍還很有限。近幾年在國(guó)內(nèi)外研究中出現(xiàn)了多種新技術(shù)與SSH技術(shù)結(jié)合．使SSH技術(shù)日臻完善．在瓜菜作物研究上的應(yīng)用也越來(lái)越多。顯示出了廣闊的研究前景。