李厚勇 周 梁 田 潔

[摘要] 目的 研究ERK信號通路對惡性黑色素瘤細胞周期的影響及其機制。方法 選用持續(xù)活化的ERK細胞株A-375,用MEK抑制劑PD98059阻斷ERK信號通路,觀察細胞生長曲線并用MTT法觀察細胞增殖,用Western蛋白印跡法檢測活化的ERK和細胞周期蛋白Cycline D1的表達,用流式細胞儀檢測細胞周期。結(jié)果ERK信號通路阻斷后,細胞周期蛋白Cyclin D1無表達,G0-1期細胞所占比例明顯增加(P<0.01),S期細胞所占比例明顯降低(P<0.01)。結(jié)論 ERK信號通路阻斷后,細胞阻滯于G0-1期。其機制與細胞周期蛋白Cyclin D1的合成抑制有關。

[關鍵詞] 惡性黑色素瘤;ERK;細胞周期;細胞周期素D1

[中圖分類號] R364.7[文獻標識碼] A[文章編號] 1004-8650(2009)12-033-04

目前研究發(fā)現(xiàn)皮膚惡性黑色瘤中存在細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extra cellular regulated protein kinase ERK)的持續(xù)活化,其所占比率為78.5%(8),而ERK信號通路是信號從細胞表面?zhèn)鲗У郊毎藘?nèi)部的重要傳遞者,參與了正常細胞的增殖、轉(zhuǎn)化、分化、死亡過程,其在不同細胞中的作用有所不同。在正常細胞中,其活化與細胞外信號刺激有關。那么ERK的持續(xù)活化在惡性黑色素瘤細胞起何作用,其作用機制又如何呢?本實驗用ERK信號通路阻斷劑PD98059阻斷惡性黑色素瘤細胞株A-375中ERK的活化,觀察黑色素瘤細胞增殖和細胞周期的變化,擬對上述問題進行初步研究。

1材料與方法

1.1惡性黑色素瘤細胞株A-375來源于中國科學院上海分院細胞所。

1.2試劑與儀器

1.2.1主要試劑:PD98059(Cayman 公司),以DMSO溶解,PBS稀釋,兔抗人Cycline D1抗體(Cell Signaling technology 公司),DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serumFBS)、胰蛋白酶(均為GIBCO公司)。Propidium iodide (PI),噻唑藍(MTT)。

1.2.2主要儀器:COULTER Epics XL 流式細胞儀(COULTER公司),相差顯微鏡(Leica 公司),BIO-RAD model 680 microplate READER 酶標儀(BIO-RAD公司)。

1.2方法

細胞生長曲線:用惡性黑色素瘤細胞株A-375以6X104個細胞/孔的密度接種于24孔板,培養(yǎng)液為含10%FBS、青鏈霉素雙抗的DMEM,24小時后實驗組培養(yǎng)液換成10%FBS、50μMPD98059、青鏈霉素雙抗的DMEM,對照組培養(yǎng)液不變。然后每隔24小時任意選取3孔進行細胞計數(shù),連續(xù)6天,繪制出細胞生長曲線。

MTT檢測:將A-375細胞以5X103個/孔的密度接種于96孔板,培養(yǎng)液為含10%FBS、青鏈霉素雙抗的DMEM,24小時后實驗組培養(yǎng)液改為培養(yǎng)液為含10%FBS、50μMPD98059、青鏈霉素雙抗的DMEM,另設一組為空白對照組(只加培養(yǎng)液、MDMSO,不加細胞),每組設8個復孔。按照MTT常規(guī)方法進行實驗,分別于培養(yǎng)后24h、48h、72h后檢測各孔490nm吸光度A值。

Western蛋白印跡法檢測各組細胞中磷酸化ERK酶和CyclineD1的表達:抽提培養(yǎng)24h各組細胞總蛋白后,進行SDS-PAGE凝膠電泳,然后用轉(zhuǎn)移槽將蛋白質(zhì)從凝膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,用抗體耦聯(lián)物進行免疫檢測,用發(fā)光底物顯跡。

細胞周期檢測:用惡性黑色素瘤細胞株A-375以1X106個細胞/瓶的密度接種在含10%FBS、青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)瓶中,24小時后分別換成10%FBS、青鏈霉素雙抗的DMEM,10%FBS、青鏈霉素雙抗、50μMPD98059的DMEM。培養(yǎng)72小時后檢測細胞周期。

流式細胞儀檢測細胞周期:吸出到期培養(yǎng)細胞瓶中的培養(yǎng)液,加入0.25%的胰酶1ml,在室溫下消化細胞1分鐘,吸出胰酶,加入培液吹打制成細胞懸液,移入離心管,以1500rpm離心5分鐘,棄上清液,加入4。C0.01MPBS,輕輕震蕩使細胞懸浮,以1500rpm離心5分鐘,棄上清液,重復2次,將細胞重懸于400μl DNA-PREP LPR 液中,避光室溫下反應15分鐘,再加入100μl PI搖勻,避光室溫下反應15分鐘,上機檢測。

統(tǒng)計學處理:采用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示,兩組比較采用t檢驗。

2結(jié)果

MTT法顯示PD98059組吸光A值明顯低于10%FBS組,兩組間P值分別為24h P=0.012<0.05, 48h P=0.001<0.01, 72h P=0.001<0.01見表1

Western檢測結(jié)果

PD98059作用24h 細胞中無磷酸化ERK酶及細胞周期蛋白CyclineD1的表達

用t檢驗比較兩組各期細胞差異,發(fā)現(xiàn)PD98059組G0-1期細胞比例明顯高于對照組(p=0.001<0.01),而S期細胞比例明顯低于對照組(p=0.001<0.01),G2期差異無顯著性(p=0.248>0.05)(表2)。

相差顯微鏡觀察兩組細胞,發(fā)現(xiàn)PD98059作用72小時組的細胞較對照組稀疏,且出現(xiàn)凋亡(圖六、圖七)。

3討論

細胞周期也稱細胞分裂周期(Cell-Division Cycle),是指一個連續(xù)分裂的細胞從一次分裂完成開始,到下一次分裂完成為止所經(jīng)歷的全過程?？蓪⑵浞譃?個時期(1):G1期、S期、G2期和M期。正常細胞的生長增殖受細胞外信號的調(diào)節(jié),許多影響細胞增殖的調(diào)控都發(fā)生在細胞周期的G1期,細胞在不適合的條件下會減慢或停止分裂,細胞周期的行進停滯在G1期,細胞進入一種靜息狀態(tài),稱為G0期。細胞在G0期可以長期存活而不增殖,當受到增殖信號的刺激后,G0期的細胞可以重新回到G1期。

細胞周期行進是由細胞周期蛋白依賴的蛋白激酶CDKs(Cyclin-dependent kinase)觸發(fā)的,CDKs通過對靶蛋白(通常是和復制、轉(zhuǎn)錄有關的因子)的磷酸化改變其活性,從而驅(qū)動細胞周期的運行(2)。具有細胞周期調(diào)控功能的CDKs大都是Cyclin依賴性的。Cyclin是CDKs的活化亞單位Cyclin即周期蛋白或周期素,因其表達水平在細胞周期過程中的時相性波動而得名。在細胞周期調(diào)控中較為關鍵的細胞周期蛋白Cyclin有A、B、D、E等。根據(jù)其含量累積達到高峰時所處的細胞周期時相不同,可以將Cyclin分為兩類:G1期和M期Cyclins。前者包括Cyclin D、E,后者主要有CyclinA、B。

Cyclin D主要作用于G0/G1期轉(zhuǎn)換,它是外部生長信號的主要感受器,它的轉(zhuǎn)錄、合成都依賴于生長信號調(diào)節(jié)。生長信號通過Ras-Raf-1-MEK-MAPKs等級聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導通路的介導,傳入核內(nèi),激活Cyclin D1基因的啟動子,從而使Cyclin D1表達水平上升,與CDK4/6結(jié)合并激活后者的活性(3,4,5),使細胞進入分裂周期開始分裂增殖。

目前研究發(fā)現(xiàn)ERK酶的活性在惡性黑色素瘤中持續(xù)增高(8,9),其腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關,且Sauter等(7)等研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1 在惡性黑色素瘤細胞的增殖中起著重要作用。那么持續(xù)活化的ERK酶是否導致惡性黑色素瘤細胞Cyclin D1基因的持續(xù)表達,從而使Cyclin D1表達水平上升,促使腫瘤細胞進入細胞分裂周期,引起腫瘤細胞的異常增殖?

為研究這一問題,我們用PD98059阻斷ERK信號通路并用Western蛋白印跡法檢測Cyclin D1的表達,并觀察惡性黑色素瘤細胞周期的變化。PD98059是MEK的阻斷劑(6),可以抑制MEK的磷酸化,從而抑制ERK的磷酸化,阻斷ERK信號通路,是研究ERK信號通路在細胞中作用時常用的藥物。在我們的實驗中可以看到,在惡性黑色素瘤細胞株A-375中,存在持續(xù)活化的ERK,且Cyclin D1 呈陽性表達,當用了該阻滯劑后,沒有活化的ERK表達,ERK信號通路被阻斷。從我們的實驗結(jié)果可以看出ERK信號通路被阻斷后,細胞周期蛋白D1呈陰性表達,腫瘤細胞增長停滯。通過對細胞周期的分析,發(fā)現(xiàn)ERK信號通路阻斷后,G0-1期細胞比例明顯上升,差異有顯著性,而S期細胞明顯減少,差異也有顯著性,這說明ERK信號通路阻斷后,對細胞周期的影響在于阻止G0-1期進入S期,而不影響已進入S期的細胞進入G2期,這樣就造成了G0-1期細胞比例上升,而S期細胞比例下降。

從我們的試驗結(jié)果可以看出惡性黑色素瘤中ERK酶的活性持續(xù)增高,可以導致細胞周期蛋白D1的表達,引起細胞進入分裂周期,促進腫瘤細胞增殖。 附圖

參考文獻

[1] Sherr CJ. Mammalian G1 cyclins.Cell. Vol 73 (6),1993: 1059-1065.

[2] Chellappan SP,Giordano A, Fisher PB.Role of cyclin-dependent kinase and their inhibitors in cellular differentiation and development. Curr Top Microbio. Vol 227 1998:57-103

3 Chang F,Steelman LS, Lee JG, et al. Regulation of cell cycle progression and apoptosis by the Ras/Raf/MEK/ERK pathway. Int J Oncol vol 22(3),2003:469-480.

4 Strniskova M,Barancik M,Ravingerova T. Mitogen-activated protein kinases and their role in regulation of cellular processes. Gen Physiol Biophys,vol 21(3),2002:231-255

5 Zhang W,Liu HT,. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferationin mammalian cells. Cell Res,12(1),2002:9-18.

6 Dudley DT,Pang L,Decker ST,et al.A synthetic inhibitor of the mitogen-activated protein kinase cascade. Pro.Natl.Acad.Sci. vol 92 1995:7686-7689

7 Sauter ER,Yeo UC, von Stemm A,et al. Cyclin D1 is a candidate oncogene in cutaneous melanoma.Cancer Res,vol 62,2002:3200-3206.

8 Takata M,Goto Y,Ichii N,et al. Constitutive activation of the mitogen-activated protein kinase signaling pathway in acral melanomas.J Invest Dermatol,vol 125,2005:318-322

9 Cohen C, Zavala PA,Sequeira JH,et al.Mitogen-actived protein kinase activation is an early event in melanoma progression. Clin Cancer Res.vol 8,2002:3728-3733

(收稿日期2009-10-26)