陳儒鋼 鞏振輝 逯明輝 李大偉 黃煒

（西北農(nóng)林科技大學園藝學院，陜西楊凌，712100）

植物基因克隆技術(shù)的發(fā)展與展望

陳儒鋼 鞏振輝 逯明輝 李大偉 黃煒

（西北農(nóng)林科技大學園藝學院，陜西楊凌，712100）

基因克隆技術(shù)是生命科學技術(shù)領(lǐng)域里非常重要的部分，為了縱覽植物基因克隆的理論和技術(shù)的發(fā)展創(chuàng)新歷程，對各種技術(shù)體系，正向遺傳學途徑、反向遺傳學途徑（包含定位克隆和同源序列克隆及隨后發(fā)展起來的電子克?。┻M行了綜述。隨著后基因組時代的到來，植物基因克隆技術(shù)將發(fā)揮更加重要的作用。

基因克隆 功能克隆 定位克隆 轉(zhuǎn)座子標簽法 抑制性差減雜交 同源序列法 基因芯片 電子克隆

植物基因的克隆技術(shù)是生命科學研究的重要組成部分，是現(xiàn)代生命科學技術(shù)中最核心的內(nèi)容，它是隨著20世紀70年代初DNA體外重組技術(shù)的發(fā)明而發(fā)展起來的，其目標是識別和分離特異基因并獲得基因完整序列，確定其在染色體上的位置，闡明其生化功能，并利用生物工程手段應(yīng)用到生產(chǎn)實踐中去。一般來講，基因克隆的策略可分為兩種途徑：正向遺傳學途徑和反向遺傳學途徑。正向遺傳學途徑以待克隆的基因所表現(xiàn)的功能為基礎(chǔ)，通過鑒定基因的表達產(chǎn)物或表型性狀進行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遺傳學途徑則著眼于基因本身特定的序列或者在基因組中的特定位置進行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；隨著DNA測序技術(shù)和生物信息學的發(fā)展，又產(chǎn)生了電子克隆等新興克隆技術(shù)。目前，在玉米，水稻、油菜、擬南芥、煙草、番茄等多種植物中，已經(jīng)克隆了許許多多與植物的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性及農(nóng)藝性狀等相關(guān)的基因?，F(xiàn)對在植物基因克隆過程中運用的主要技術(shù)進行綜述，以把握植物基因克隆技術(shù)的發(fā)展歷程，并對未來的發(fā)展趨勢進行展望。

1 功能克隆

功能克?。‵unctional Cloning）就是從蛋白質(zhì)的功能著手進行基因克隆，是人類采用的第一個克隆基因的策略。其基本內(nèi)容為：根據(jù)已知的生化缺陷或特征確認與該功能有關(guān)的蛋白質(zhì)，分離純化蛋白并測定出部分氨基酸序列，根據(jù)遺傳密碼推測其可能的編碼序列，設(shè)計相應(yīng)的核苷酸探針，雜交篩選cDNA文庫或基因組文庫，或者使用該蛋白質(zhì)特異的抗體，篩選表達載體構(gòu)建的cDNA文庫，通過抗原抗體反應(yīng)尋找特異的克隆，最后對選中的克隆測序，獲得目的基因的序列。用這一策略克隆基因的關(guān)鍵在于必須首先分離出一個純的蛋白，測定出其一部分氨基酸序列或得到相應(yīng)抗體；其次要構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫；然后要對文庫進行雜交篩選。Li L G等通過功能克隆的方法，從擬南芥中克隆到一個解毒外運載體蛋白基因并發(fā)現(xiàn)了一個包含至少56個編碼相關(guān)蛋白基因的基因家族[1]。隨著生命科學研究的深入，以及蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)和蛋白質(zhì)測序技術(shù)的日趨成熟與完善，各種差異表達的蛋白質(zhì)將被大量分離純化，必將給功能克隆提供更好的條件，使之得到更加廣泛的應(yīng)用，功能克隆將會繼續(xù)發(fā)揮其重要作用。

2 定位克隆

定位克隆技術(shù) （positional cloning）又叫圖位克?。╩ap-based cloning），是根據(jù)目標基因在染色體上的位置進行基因克隆的一種方法，適合于克隆編碼產(chǎn)物未知的基因。其基本原理是根據(jù)功能基因在基因組中存在相對較穩(wěn)定的基因座，在利用分子標記技術(shù)對目的基因進行精確定位的基礎(chǔ)上，用與目標基因兩側(cè)緊密連鎖的分子標記篩選含有大的插入片段的基因組文庫（如BAC和YAC），用篩選到的陽性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的跨疊群，再通過染色體步行（chromosome walking）逐步逼近候選區(qū)域或通過染色體登陸（chro-mosome landing）的方法獲得含有目標基因的大片段克隆，將含有目標基因的大片段克隆進行亞克隆，或以大片段克隆作探針篩選cDNA文庫；從而將目標基因確定在一個較小的DNA片段上并進行序列分析，通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補試驗分析，鑒定獲得目的基因。

植物中運用圖位克隆技術(shù)，從擬南芥、水稻、番茄、大麥、小麥、甜菜、馬鈴薯等植物中分離了幾十個重要的基因，并以抗病基因的克隆居多，如番茄的基因[2]，基因[3]；馬鈴薯的基因[4]，擬南芥的基因[5]、基因[6]、基因[7]和水稻的等基因[8～10]。近年來中科院院士、華中農(nóng)業(yè)大學教授張啟發(fā)領(lǐng)導的“基因組研究與水稻遺傳改良”國家創(chuàng)新團隊利用圖位克隆的方法相繼分離克隆出同時控制水稻株高、抽穗期和每穗粒數(shù)的基因和控制水稻秈粳不育和廣親和性狀的主效基因，以及調(diào)控水稻開花時間、影響其生長周期的基因，在水稻功能基因組研究領(lǐng)域取得重大突破[11～13]。定位克隆理論上適用于一切基因，但由于定位克隆依賴于高密度的分子標記連鎖圖譜，因此該技術(shù)對于基因組較小，重復序列少而且已經(jīng)構(gòu)建了高密度RFLP或RAPD等標記圖譜的植物無疑是非常有效的，如擬南芥、水稻等模式植物。但對于小麥、玉米等基因組大而且重復序列多，又難于構(gòu)建高密度分子標記連鎖圖的植物來說，要相對困難得多。對這類作物采用該方法分離克隆基因存在成本高、效率低、進展緩慢的缺點。但隨著比較基因組研究的興起，利用同科異種植物間染色體的共線性進行比較作圖，如以擬南芥、番茄和水稻為中介來克隆其他十字花科、茄科和禾本科植物的基因，將成為一個新的發(fā)展方向。

3 轉(zhuǎn)座子標簽法（transposon tagging）

轉(zhuǎn)座子（Transposon）是可從染色體的一個位置轉(zhuǎn)移到另一位置的DNA片段，最早在玉米中發(fā)現(xiàn)的，隨后的研究表明，在生物界中轉(zhuǎn)座子是普遍存在的，并在生物的遺傳進化方面有重要作用。轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)克隆基因的基本原理是，利用轉(zhuǎn)座子插入到基因內(nèi)部或鄰近位點，會引起相關(guān)表型突變的特點，以轉(zhuǎn)座子的已知序列為標簽，克隆因轉(zhuǎn)座子插入而功能失活的基因。如果某基因的突變是由于轉(zhuǎn)座子插入而造成的，那么以轉(zhuǎn)座子序列為探針就可從變異株的基因組中篩選出帶有此轉(zhuǎn)座子的部分基因，再以突變基因的部分序列作探針，即可從野生型文庫中克隆出完整的基因。在植物中利用轉(zhuǎn)座子的有玉米的Ac/Ds，En/Spm和金魚草的Tn3等，其中應(yīng)用最多的是Ac/Ds雙因子系統(tǒng)。

利用轉(zhuǎn)座子標記技術(shù)目前已克隆到的植物抗病基因有玉米抗圓斑病基因[14]，番茄抗葉霉病基因15-19]，煙草抗花葉病毒病基因[20]，亞麻抗銹病基因等[21～22]。該技術(shù)是目前分離克隆抗病基因有效工具之一。

隨著農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)座子導入目標植物系統(tǒng)建成后，目前已在擬南芥、番茄、水稻中有廣泛的運用。同時，隨著擬南芥、水稻等模式植物的基因組測序完成，研究的熱點轉(zhuǎn)向功能基因組，轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)己經(jīng)成為構(gòu)建植物突變體庫，進行基因功能研究的核心技術(shù)。

4 抑制性差減雜交

抑制消減雜交技術(shù)（SSH）是1996年由Diatchenko L建立的以抑制性PCR為基礎(chǔ)的DNA消減雜交方法[23]。其依據(jù)的技術(shù)主要有兩點：①消減雜交；②抑制PCR。經(jīng)抑制消減雜交后的cDNA群體不僅富集了差異表達基因（目的基因），而且目的基因間豐度的差異經(jīng)過均等化作用已基本消除，使消減后的cDNA群體為豐度一致的目的基因群體。

與其他差異表達基因克隆技術(shù)相比，SSH技術(shù)具有明顯的優(yōu)越性：①假陽性率大大降低，這是它的最大優(yōu)點。這是由它的兩步消減雜交和兩次抑制PCR所保證的。②高敏感性。在DDRT和cDNA-RDA中，低豐度的mRNA一般不易被檢出，SSH方法所做的均等化和目標片段的富集，保證了低豐度mRNA也可能被檢出。③速度快，效率高。一次SSH反應(yīng)可以同時分離幾十或成百個差異表達基因。另外，此技術(shù)還具有背景低、重復性好的特點。

SSH技術(shù)作為一種較為有效的分離差異表達基因的方法，已經(jīng)被廣泛用于豌豆對枯萎病的抗性機理研究[24]，馬鈴薯晚疫病抗病相關(guān)基因的分離研究[25]，大豆花葉病毒誘導特異表達基因的分離[26]，水稻幼穗發(fā)育早期特異表達基因的分離[27]，胡蘿卜體細胞胚根發(fā)育相關(guān)基因的分離[28]，及玉米耐鋁離子毒害基因的分離[29]等方面，顯示了良好的應(yīng)用前景。

SSH也有一定的缺點：①SSH技術(shù)需要幾微克量的mRNA，如果量不夠，那么低豐度的差異表達基因的cDNA很可能會檢測不到，這是SSH技術(shù)不能被廣泛應(yīng)用的主要障礙。②SSH技術(shù)得到的cDNA是限制酶消化的cDNA，不再是全長cDNA，當然，這個缺陷可以通過篩選cDNA文庫或者采用RACE的方法獲得全長目的基因。③不能同時對數(shù)個材料進行比較，材料之間存在過多的差異及小片段缺失也不能被有效檢測。

5 同源序列法

同源序列法是根據(jù)與待克隆基因同源的已知序列進行基因克隆的方法。目前很多植物基因序列已知，當要克隆類似基因時可先從Genbank庫中找到有關(guān)基因序列，設(shè)計出特異引物；以植物基因組DNA或者cDNA為模板，采取PCR或RT-PCR的方法來擴增目的基因；擴增的片段經(jīng)純化后，連接到合適的載體上，進行序列分析、比較驗證并確認目的基因的克隆。這是PCR技術(shù)誕生后出現(xiàn)的一種快速、簡便克隆植物基因的方法?？共』蛲葱蛄蟹?（Resistance gene analogs，RGAs）也屬于同源序列克隆的范圍。盡管抗病基因的病原物種類不同，但這些抗病基因的產(chǎn)物（即在抗病反應(yīng)中起重要作用的蛋白質(zhì)）卻存在著非常類似的結(jié)構(gòu)域，如核苷酸結(jié)合位點（NBS)、富亮氨酸重復序列（LRR）、絲氨酸蘇氨酸激酶（STK）、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（LZ）、跨膜結(jié)構(gòu)域（TM）、TIR（白介素-1區(qū)域）等。利用這些保守結(jié)構(gòu)域的特性，設(shè)計特異性的簡并引物，以植物總DNA、cDNA為模板進行PCR擴增，就可得到抗病基因的候選片段，再通過分析驗證、確認目的基因的克隆。王石平等根據(jù)這些保守序列設(shè)計合成了特異性和兼并性引物，對水稻基因組DNA進行擴增，得到了100個大小不同的克隆，定位了26個克隆，其中10個克隆與8個已定位的水稻抗病基因在分子標記連鎖圖上的位置對應(yīng)或毗鄰，這表明這些克隆的抗病基因在染色體位置上有較好的對應(yīng)關(guān)系，證明了同源序列分離和克隆基因的可能性[30]。Chen R G等根據(jù)這些保守序列設(shè)計合成兼并性引物，對抗根結(jié)線蟲辣椒DNA進行擴增，獲得了25個抗病基因同源序列，聚類分析將其分為7個不同的類別。根據(jù)其中與番茄抗根結(jié)線蟲基因同源性較高的RGA序列信息，克隆了辣椒抗根結(jié)線蟲基因[31]。

6 基因芯片技術(shù)（gene chips）

基因芯片又稱DNA芯片、DNA微陣列 （DNA microarray），是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測的標記樣品的基因按堿基配對原理進行雜交，再通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測，從而迅速得出所要的信息?；蛐酒哂懈咄俊⒏咝畔⒘?、快速、并行檢測、樣品用量少、用途廣泛等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到基因表達檢測、突變檢測、基因組多態(tài)性分析和基因文庫作圖以及雜交測序等方面。基因芯片根據(jù)功能可分為基因表達芯片（gene expression microarray）和DNA測序芯片 （DNA sequencing chip）2類；按基因芯片的用途可分為表達譜芯片、診斷芯片、指紋圖譜芯片、測序芯片等；根據(jù)所用探針的類型可分為cDNA微陣列芯片和寡核苷酸陣列芯片。

李永春等為探討小麥水分脅迫反應(yīng)的分子調(diào)控機制，以抗旱小麥品種 “洛旱2號”根系為材料，采用Affymetrix小麥基因芯片比較了20%PEG6000溶液處理后根系及對照的基因表達譜，篩選到一批水分脅迫響應(yīng)基因，涉及到生物代謝、逆境脅迫反應(yīng)、細胞組分生成、蛋白合成、細胞信號交流、細胞運輸、轉(zhuǎn)錄相關(guān)、細胞分裂和蛋白質(zhì)加工等多個功能基因群，為克隆抗旱基因及開展抗旱分子育種提供了有用信息，也為進一步探討小麥水分脅迫反應(yīng)的分子調(diào)控機制積累了重要資料[32]。張曉婷等利用Affymetrix水稻全基因組芯片對水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）接種后出現(xiàn)條紋癥狀第7天的武育粳3號水稻病葉和相應(yīng)的健康葉片進行了全基因組表達譜分析，得到3517個差異基因，其中2002個表達上調(diào)，1515個表達下調(diào)。根據(jù)TIGR數(shù)據(jù)庫注釋和MIPS基因功能分類標準將差異基因歸類為15個功能類別，多數(shù)差異基因與植物防御、信號傳導及蛋白質(zhì)、碳水化合物的代謝相關(guān)，一些轉(zhuǎn)錄因子的表達也發(fā)生了明顯的變化。代謝途徑分析表明，RSV侵染后磷酸戊糖途徑、類黃酮合成途徑和蕓薹素合成途徑的相關(guān)基因表達明顯增強，赤霉素合成途徑相關(guān)基因的表達受到了抑制[33]。

基因芯片與傳統(tǒng)的膜雜交相比有以下優(yōu)點：①芯片點樣密度遠遠高于膜的點樣密度、樣品用量少、信息量大。②芯片可用雙色熒光標記兩種探針，這樣數(shù)據(jù)準確度大大提高；而膜通常用核素標記探針，一張膜只能雜交一種探針，數(shù)據(jù)可比性差；③芯片雜交體積小，靈敏度高；膜雜交體積大，靈敏度差；④芯片具有表面平整性好、硬度大、透明等特點，比易卷曲的膜雜交更容易在點樣、雜交、圖像處理及數(shù)據(jù)采集等方面自動化?；蛐酒哂懈咄?、高信息量、快速、樣品用量少、造價低、用途廣泛等優(yōu)點。

7 電子克?。╡lectronic cloning）

電子克隆，又稱計算機雜交 （computer hybridization），是以數(shù)學算法為手段，以計算機和互聯(lián)網(wǎng)為工具，利用現(xiàn)有的基因序列、表達序列標簽（EST）、蛋白序列和生物信息數(shù)據(jù)庫，發(fā)掘新基因，并通過生物學試驗進行編碼序列和功能驗證而克隆基因的方法。電子克隆的理論基礎(chǔ)是利用絕大部分功能基因的編碼區(qū)比較保守，同源性較高的特點，采用生物信息學的手段，通過同源性分析延伸EST序列，以獲得基因潛在的部分乃至全長的cDNA序列。

電子克隆基因的基本過程：第一步，以感興趣的基因或同源基因的EST為查詢序列，用BLASTN檢索對應(yīng)的EST數(shù)據(jù)庫，檢出與起始查詢序列有同源性或有部分重疊的EST序列，長度＞100 bp，同源性50%～85%。第二步，將檢出序列組裝為重疊群（contig），以此重疊群為被檢序列，重復進行BLAST檢索與序列組裝，延伸重疊群系列，重復以上過程，直至沒有更多的重疊EST檢出或者說重疊群序列不能繼續(xù)延伸，獲得基因的候選cDNA序列。第三步，將獲得的候選cDNA序列與GeneBank核酸數(shù)據(jù)庫進行相似性檢測。假如沒有精確匹配基因，將EST序列數(shù)據(jù)按EST六種閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)，接著與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進行比較分析。基因分折的結(jié)果大致有3種：第一是已知基因，是研究人類已鑒定和了解的基因；第二是以前未經(jīng)鑒定的新基因；第三是未知基因，這部分基因之間無同種或異種基因的匹配。第四步，對新基因和未知基因進行生物學研究，可以根據(jù)獲得的基因的候選序列設(shè)計引物，用基因組PCR或者RT-PCR的方法獲得基因的基因組序列或者cDNA序列，再進一步進行功能驗證。在電子克隆的基礎(chǔ)上，也可通過IMAGE協(xié)議索取相應(yīng)的免費克隆，以避免篩選全長基因的麻煩，以集中精力進行基因功能研究。

電子克隆充分利用已有的生物信息資源，從ESTs序列入手、通過同源篩選，獲得基因部分乃至全長cDNA序列，避免或減輕了構(gòu)建與篩選cDNA文庫等繁重、耗時的實驗室工作，將大大加快基因克隆的方法。與傳統(tǒng)的實驗室克隆基因的繁雜、耗時、費用高、效率不高的方法相比，電子克隆更為簡捷、快速、費用大大降低。隨著多種模式生物的基因組測序工作的完成，以及各種生物的EST數(shù)據(jù)庫的建立和充實，電子克隆必將在基因克隆的領(lǐng)域占有重要的一席之地，也必將加快新基因的發(fā)現(xiàn)與克隆的進程。

8 趨勢與展望

生物的基因是一片海洋，在基因克隆的領(lǐng)域，人類已經(jīng)邁出了堅實的步伐，但要徹底破譯生命的天書，基因克隆的研究仍任重而道遠，基因克隆的進展依賴于基因克隆技術(shù)的發(fā)展與創(chuàng)新。展望未來，基因克隆技術(shù)的發(fā)展將可能有以下趨勢。

①高通量，高效率，經(jīng)濟快速的基因克隆技術(shù)將會領(lǐng)導潮流，如SSH、基因芯片等。生命科學的發(fā)展一日千里，效率低下、耗時耗力的克隆技術(shù)必將退出舞臺。

②全基因組測序?qū)⒊蔀橐环N趨勢。植物中，隨著擬南芥、水稻基因組測序的完成，必將會有更多的植物進行全基因組測序，如玉米、柑桔等就是重要的候選對象。

③探討眾多功能基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將成為今后的研究重點。當前飛速發(fā)展和不斷完善的高通量基因克隆技術(shù)，如基因芯片技術(shù)，能夠在短時間內(nèi)獲得大量的基因組表達譜數(shù)據(jù)，可以定量地、從整體上對植物功能基因的作用機理進行深入的研究，從而把對功能基因調(diào)控作用的認識從單個基因水平上升到眾多基因的網(wǎng)絡(luò)層次，整合相關(guān)研究的信息以全面認識功能基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有助于從多維度系統(tǒng)水平上為利用功能基因進行植物基因工程改良提供理論依據(jù)。

④在基因克隆中，計算機技術(shù)、電子技術(shù)將扮演更加重要的角色?；蚪M測序，基因芯片，電子克隆等技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展，都與計算機技術(shù)的發(fā)展息息相關(guān)。面對日益增多的生物信息的海洋，沒有計算機技術(shù)和電子技術(shù)的輔助，人類只能望洋興嘆。

⑤不同的基因克隆技術(shù)之間的相互交叉融合。例如抑制消減雜交與基因芯片技術(shù)相結(jié)合，電子克隆與RT-PCR相結(jié)合等，將顯示出巨大的應(yīng)用前景。

[1]Li L G,He Z Y,Pandey G K,et al.Functional cloning and characterization of a plant efflux carrier for multidrug and heavy metal detoxification[J].J Biol Chem,2002,277（2）：5360-5368.

[2]Milligan S B,John B,Yaghoobi J,et al.The root nematode resistance gene Mi from tomato is a member of the leucine zipper,nucleotide binding,leucine-rich repeat family of plant genes[J].Plant Cell,1998,10:1307-1319.

[3]Emst K,Amar K,Doris K.The broad-spectrum potato cyst nematode resistance gene (Hero)from tomato is the only member of a large gene family of NBS-LRR genes with an unusual amino acid repeat in the LRR region[J].Plant J, 2002,31:127-136.

[4]van der Vossen E A G,van der Voort J,Kanyuka K.Homologues of a single resistance-gene cluster in potato confer resistance to distinct pathogens:a virus and a nematode [J].Plant J,2000,23:567-576.

[5]Xiao S,Ellwood S,Calis O,et al.Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8[J]. Science,2001,291:118-120.

[6]Swiderski M R,Innes R W.The Arabidopsis PBS1 resistance gene encodes a member of a novel protein kinase subfamily[J].Plant J,2001,26:101-112.

[7]Bittner-Eddy P D,Crute E B,Holub J L,et al.RPP13 is a simple locus in Arabidopsis thaliana for alleles that specifiy downy mildew resistance to different avirulence determinants in Peronospora parasitica[J].Plant J,2000,21:177-188.

[8]Bryan G T,Wu K,Farrall L,et al.A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta[J].Plant Cell,2000,12: 2033-2045.

[9]Yoshimura S,Yamanouchi,U,Katayose Y,et al.Expression of Xa1,a bacterial blight resistance gene in rice,is induced by bacterial inoculation[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998, 95:1663-1668.

[10]Wang Z X,Yano M,Yamanouchi U.The Pi-b gene for rice blast resistance belongs to the nucleotide binding and leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes [J].Plant cell,1999,19:55-64.

[11]Xue W Y,Xing Y Z,Weng X Y,et al.Natural variation in Ghd7 is an important regulator of heading date and yield potential in rice[J].Nat Genet,2008,40:761-767.

[12]Chen J,Ding J,Ouyang Y,et al.A triallelic system of S5 is a major regulator of the reproductive barrier and compatibility of indica-japonica hybrids in rice[J].Proc Natl Acad Sci USA.2008,105(32):1136-1146.

[13]Wu C Y,You C J,Li C H,et al.RAD1,encoding a Cys2/ His2-type zinc finger transcription factor,acts as a master switch from vegetative to floral development in rice[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2000,105:12915-12920.

[14]Multani D S,Meeley R B,Paterson A H,et al.Plantpathogen microevolution:molecular basis for the origin of a fungal disease in maize [J].Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95:1686-1691.

[15]Dixon M S,Johes D A,Keddie J S,et al.The tomato Cf-2 disease resistance locus comprises two functional genes encoding leucine-rich repeat protein[J].Cell,1996,84: 2451-2459.

[16]Kruijt M,Kip D J,Joosten M H,et al.The Cf-4 and Cf-9 resistance genes against Cladosporium fulvumare conserved in wild tomato species[J].Molecular Plant-microbe Interactions,2005,18(9):1011-1021.

[17]Dixon M S,Hatzixanthis K,Jones D A,et al.The tomato Cf-5 disease resistance gene and six homologs show pronounced allelic variation in leucine-rich repeat copy number[J].Plant Cell,1998,10:1915-1925.

[18]Jones D A,Thomas C M,Hammondkosack K E,et al.Isolation of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum by transposon tagging[J].Science,1994,266: 789-793.

[19]Richard L,Matthieu H A T,Joosten J,et al.Successful search for a resistance gene in tomato targeted against a virulence factor of a fungal pathogen [J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:9014-9018.

[20]Whitham S,Dinesh-kumar S P,Choi D,et al.The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N:similarity to toll and interleukin-1 receptor[J].Cell,1994,78:1101-1115.

[21]Lawrence G J,Finnegan E J,Ayliffe M A,et al.The L6 gene for flax rust resistance is related to the Arabidopsis bacterial resistance gene RPS2 and the tobacco viral resistance gene N[J].Plant Cell,1995,7:1195-1206.

[22]Anderson P A,Lawrence G J,Morrish B C,et al.Luactivation of the flax rust resistance gene M associated with loss of a repeated unit with in the leucine-rich repeat coding region[J].Plant Cell,1997,9:641-651.

[23]Diatchenko L,Lau Y C,Campbell A P,et al.Suppression subtractive hybridization: A method for generating differentially regulated or tissue specific cDNA probes and libraries[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:6025-6030.

[24]Hiroyuki T,Kazuhiro T,Gento T,et al.Identification of genes expressed during spore germination of Mycosphaerella pinodes [J].J Gen Plant Pathol,2005,71: 190-195.

[25]田振東，柳俊，謝從華.利用抑制差減雜交技術(shù)分離馬鈴薯晚疫病抗性相關(guān)基因[J].遺傳學報，2003，30（7）：597-605.

[26]劉春燕，王偉權(quán)，陳慶山，等.大豆花葉病毒誘導的消減文庫構(gòu)建及初步分析[J].生物工程學報，2005，21（2）：320-322.

[27]劉軍，袁自強，劉建東，等.應(yīng)用抑制消減雜交分離水稻幼穗發(fā)育早期特異表達的基因[J].科學通報，2000，45（13）：1392-1397.

[28]張雷，楊志攀，劉一鳴，等.cDNA文庫的差異篩選與抑制性減數(shù)雜交相結(jié)合分離胡蘿卜體細胞胚根發(fā)育相關(guān)基因[J].自然科學進展，2002，12（3）：261-265.

[29]湯華，鄭用璉，賀立源，等.玉米耐鋁毒基因的分離[J].植物生理與分子生物學學報，2005，31（5）：507-514.

[30]王石平，劉克德，王江，等.用同源序列的染色體定位尋找水稻抗病基因DNA片段[J].植物學報，1998，40（1）：42-50.

[31]Chen R G,Li H X,Zhang L Y,et al.CaMi,a root-knot nematode resistance gene from hot pepperconfers nematode resistance in tomato[J].Plant cell reports,2007,26:895-905.

[32]李永春，孟凡榮，王瀟，等.水分脅迫條件下“洛旱2號”小麥根系的基因表達譜[J].作物學報，2008，34（12）：2126-2133.

[33]張曉婷，謝荔巖，林奇英，等.水稻條紋病毒脅迫下的水稻全基因組表達譜[J].激光生物學報，2008，17（5）：620-629.

Development and Prospect of the Gene Cloning Technology in Plant

CHEN Rugang,GONG Zhenhui,LU Minghui,LI Dawei,HUANG Wei

Gene cloning technology is a very important in life science area.In order to insight the development and renovation process of gene cloning theories and techniques,many important cloning technique system applied in plant research were reviewed.Forward genetics strategy was based on expressed functions of genes,which by means of identifying the product or the mutant phenotype of gene.Forward genetics strategy included two aspects:functional cloning and phenotype cloning.Reverse genetics strategy was founded on the special location and sequences of gene itself,including positional cloning,homology cloning,and electronic cloning which developed in recent years.With the advent of post-genome era,plant gene cloning technology will play more important role in the future.

Gene cloning;Functional cloning;Positional cloning;Transposon tagging;Suppression subtractive hybridization;Homology cloning;Gene chips;Electronic cloning

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.20.004

國家自然科學基金（30571262）；“十一五”國家科技支撐計劃（2006BAD01A7）；西北農(nóng)林科技大學“青年學術(shù)骨干支持計劃”（01140304）；西北農(nóng)林科技大學人才基金（01140508）

陳儒鋼（1978-），男，博士，講師，主要從事蔬菜育種與生物技術(shù)的研究。E-mail：rugangchen@126.com

鞏振輝，通信作者，博士生導師，主要從事蔬菜種質(zhì)資源與育種及生物技術(shù)的研究。E-mail：gzhh168@yahoo.com.cn

2009-06-02