張　玲　胡朝暉　吳　鵬　方　菊　朱慶義

[摘要] 目的 比較4種方法（電泳法、wHPLC、MCV法、一管法）篩查Hb病的檢出效能及其準(zhǔn)確性，為臨床尋求一種較理想的篩查方法，提高實(shí)驗(yàn)診斷率。 方法 選擇2007-2008年間在我中心進(jìn)行婚檢、孕檢、產(chǎn)檢及體檢標(biāo)本9203例，同時(shí)采用電泳法、wHPLC（弱陽離子交換色譜法）、MCV法(平均紅細(xì)胞體積測定)、紅細(xì)胞脆性實(shí)驗(yàn)（一管法）進(jìn)行檢測，對(duì)1523例疑為Hb病篩查實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回顧性分析。 結(jié)果 4種方法篩查Hb病的檢出率分別為16.5%、16.5%、16.8%、8.3%。準(zhǔn)確率分別為90%、92%、96%、52%，4種篩查方法檢出率及準(zhǔn)確率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。電泳法、wHPLC法、MCV法對(duì)篩查Hb病檢出率明顯高于一管法。 結(jié)論 聯(lián)合應(yīng)用電泳法、wHPLC（弱陽離子交換色譜法）及MCV法，能有效地檢出Hb病患者。紅細(xì)胞脆性實(shí)驗(yàn)（一管法）存在一定的漏檢率，篩查效能差，不具備單獨(dú)應(yīng)用的臨床價(jià)植。

[關(guān)鍵詞]血紅蛋白?。浑娪痉?；弱陽離子交換色譜法；MCV法；紅細(xì)胞脆性實(shí)驗(yàn)

The comparison of four screening methods for hemoglobinopathies

ZHANG Ling, HU Zhao-hui, WU Peng，et al.Guangzhou Kingmed Center for Clinical Laboratory, Guangzhou 510330 , China

【Abstract】 Objective The purpose of the study was to look for an optimal screening method to improve the diagnostic rate for hemoglobinopathies. To achieve this goal, four methods including Hemoglobin(Hb) electrophoresis, weak cation exchange HPLC (wHPLC), red cell mean corpuscular volume (MCV) test and red cell osmotic fragitity ( one tube method) are compared in the study for the diagnosis of hemoglobinopathies, Antenatal examination.Methods9203 samples for pre-marital check-ups, maternal screening, and health exams during 2007 - 2008 in KingMed center were compared with Hb electrophoresis, wHPLC, MCV, red cell osmotic fragitity (one tube method) test at the same time. 1523 samples with suspended hemoglobinopathies were analysed with regression.Results The positive rate of four methods in screening hemoglobinopathies were 16.5%, 16.5%, 16.8% and 8.3%,, while accuracy rate were 90%, 92%, 96% and 52%, respectively. The positive rate and accuracy were different significantly (P<0.01) Positive rate in electrophoresis, wHPLC, and MCV are higher than one tube method. Conclusion Combination with electrophoresis, wHPLC and MCV

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作者簡介：張玲，女，（1975,11－），2005年廣州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，檢驗(yàn)技師，主要從事免疫血液學(xué)工作。

methods are effectively to screen hemoglobinopathies patients. red cell osmotic fragility test (One tube method) consists in higher false negative rate and is limited in independent use in screening hemoglobinopathies.

【Key words】 Hemoglobinopathies;Electrophoresis;Weak cation exchange HPLC; MCV, red cell osmotic fragility test

血紅蛋白病是由于珠蛋白基因編碼突變造成的一種珠蛋白肽鏈結(jié)構(gòu)異常性疾病，如HbE、HbG、HbQ、HbS等，地中海貧血是珠蛋白基因內(nèi)部或其旁側(cè)序列的突變，使受累基因表達(dá)下降，珠蛋白α和非α肽鏈比例失衡所致的溶血性貧血，簡稱地貧，這是兩種常見的遺傳性疾病[1]。近年來，分子生物學(xué)研究表明，不管是Hb病，還是地貧，其分子基礎(chǔ)是共同的，都是由于珠蛋白基因的突變所致[2]。地貧是危害公共健康的一種主要疾病，我國華南地區(qū)是地貧的高發(fā)區(qū)。目前，國內(nèi)外已較普遍應(yīng)用MCV[3]和紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)[4]低于正常值來初篩地貧攜帶者。地貧攜帶者的篩查方法有很多[5]，但各有利弊，目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的還是紅細(xì)胞指數(shù)分析法。臨床上重要的Hb變種通常是用常規(guī)的血液學(xué)方法初步篩查發(fā)現(xiàn)的。Hb水平過低、小紅細(xì)胞癥、血紅蛋白過多、網(wǎng)織細(xì)胞增多、膽紅素血癥和融珠蛋白血癥等癥狀表示可能有α或β地貧，或嚴(yán)重的不穩(wěn)定Hb類型存在。輕型地中海貧血患者的臨床癥狀和體征常不明顯，部分可能僅有伴有輕度貧血，現(xiàn)有的Hb電泳、紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)，往往不能滿足其診斷要求[6]。目前國際上明確診斷地貧主要是采用聚合酶鏈技術(shù)（PCR）結(jié)合其他分子生物學(xué)手段檢查[7，8]。但因其技術(shù)要求及費(fèi)用成本高，往往不能用于臨床篩查。因此，我們必須尋找一種檢出效能較好的Hb病篩查方法，為臨床提供可靠數(shù)據(jù)，以便可疑Hb病患者的進(jìn)一步確診，也是預(yù)防地中海貧血患兒出生的關(guān)鍵措施，綜合分析報(bào)告如下。

1．材料與方法

1.1對(duì)象：2007年12月至2008年6月來自我中心血液室進(jìn)行孕前，產(chǎn)前，婚檢及體檢的標(biāo)本（包括廣東省珠三角，粵北，粵東，粵西,廣州市，深圳特區(qū)）9203例，每例標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行血常規(guī)、Hb電泳、wHPLC、紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)檢測。部分篩查陽性標(biāo)本用PCR、RDB技術(shù)進(jìn)行α和β地貧基因檢測。對(duì)照組100例血樣采自我體檢中心4種方法檢測正常者。

1.2試劑：PH8.6瓊脂凝膠試劑由美國Helena公司提供；wHPLC（弱陽離子交換色譜法）由美國堪薩斯primus提供。地中海貧血基因試劑使用深圳益生堂生物公司及亞能公司生產(chǎn)的基因診斷試劑盒。紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)試劑(一管法),由廣州米基公司提供。

1.3儀器：美國Helena全自動(dòng)快速電泳系統(tǒng)（SPIFE）、美國PRIMUS CLC385?System- HPLC、貝克曼COULTER全自動(dòng)血球分析儀，CB171半自動(dòng)生化儀。

1.4方法：

1.4.1EDTA-K2抗凝血2.0ml，采用貝克曼COULTER全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀作血常規(guī)分析，同時(shí)作質(zhì)控檢測。

1.4.2Hb成份分析：EDTA-K2抗凝血2 ml，AFSA2 HEMO CONTROLCat.No.5330

Lot No：3-07-5330 Exp.Date：10/08采用美國Helena公司全自動(dòng)快速電泳系統(tǒng)（SPIFE），于pH 8.6瓊脂糖凝膠電泳，在堿性條件下瓊脂凝膠，可分離出各種Hb區(qū)帶,進(jìn)行定性或定量檢測各種Hb區(qū)帶，同時(shí)進(jìn)行Heinz小體試驗(yàn)（主要用于a地貧的鑒別）。

1.4.3弱陽離子交換色譜法-HPLC：2.7 ml全血加入含0.3 ml EDTA-K2試管或檸檬酸鹽緩沖液中，HEMOGLOBINA2，F(xiàn) CONTROLS，Level I Low A2，High F，Level II High A2，Low F，Cat.No .01-04-0043，樣本直接上機(jī)或稀釋后上機(jī)均可同時(shí)進(jìn)行。使用Primus CLC 385機(jī)型及Primus公司地貧試劑盒（可同時(shí)檢測α和βThal），在該系統(tǒng)檢測中有三套程序供選用：Quick Scan ( 5.5 min )、High Resolution (10.5 min ) 或Quick reflex (先作quick scan，若有不正常的則自動(dòng)reflex作High resolution)。原始數(shù)據(jù)自動(dòng)儲(chǔ)存并同時(shí)打印色譜報(bào)告。實(shí)驗(yàn)操作完全按照儀器使用說明。

1.4.4紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)（一管法）：嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作，正常值為溶血百分率＞60%，如果＜60%可判定為脆性陽性。

1.4.5 Thal基因檢測：GAP-PCR檢測3種常見的缺失型α- Thal基因（--SEA、-a3.7與-a4.2），試劑由亞能公司提供，采用PCR結(jié)合反向點(diǎn)雜交法檢測β-珠蛋白基因17個(gè)位點(diǎn)的18種突變，試劑由深圳益生堂生物公司提供。

1.4.6 判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》［9］,電泳法結(jié)果診斷α-Thal時(shí), HbA2臨界值為≤2.5%, 診斷β-Thal時(shí), HbA2臨界值為≥3.5%; wHPLC結(jié)果診斷α-Thal為≤2.1%，β-Thal為≥3.0%(wHPLC參考值為本室自建中國正常成人參考范圍)，以基因結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)。

2. 結(jié)果

2.1 2007年12月至2008年6月共對(duì)9203例標(biāo)本進(jìn)行HB病篩查, 結(jié)果異常1523例, 用4種方法篩查(α, β-Thal, Variant Hb)檢出結(jié)果: 電泳法分別為9.7%、6.2% 、0.66%，wHPLC（弱陽離子交換色譜法）為9.6%、6.2% 、0.63%，MCV法為10.3%、6.2% 、0.26%，紅細(xì)胞脆性實(shí)驗(yàn)（一管法）為4.5%、3.7% 、0。后者與前三者存在差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）見表1。

2.21523例疑為HB病標(biāo)本4種方法檢測準(zhǔn)確率比較：紅細(xì)胞脆性實(shí)驗(yàn)（一管法）為52%，電泳法為90%，wHPLC為92%，MCV法為96%，前者與后三者存在差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）見表2。

2.3153例疑為HB病標(biāo)本進(jìn)行基因檢測結(jié)果：13例（8.5%）為β復(fù)合α-地貧1，49例為β-地貧， 其中CD41-42 25例(16.3%)， CD17 13例(8.5%), CD-28 5例(3.3%),CD71-72 3例(2%)，CD654 16例（10.5%），88例攜帶α-地貧2基因，其中67例（44%）為右側(cè)缺失型（-a3.7/aa），21例（13.7%）為左側(cè)缺失型（-a4.2/aa）；HbH病3例(2%)為(--SEA/ -a3.7、 --SEA/ -a4.2)，見表3。

2．4正常對(duì)照組100例檢出率(除1例紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)假陽性)及準(zhǔn)確率經(jīng)X2檢驗(yàn)(P>0.05)無顯著性差異。

3．討論

3.1血紅蛋白病的理想診斷方法是做蛋白的結(jié)構(gòu)分析，檢出氨基酸變異的性質(zhì)及位置,可此項(xiàng)技術(shù)在國內(nèi)未普遍開展，僅用pH8.6 TEB醋酸纖維薄膜瓊脂糖凝膠電泳，部分需用等電聚焦，聚丙烯酰凝膠電泳或HPLC等技術(shù)(國外已普遍應(yīng)用)。異常血紅蛋白病是一種遺傳性的珠蛋白鏈分子結(jié)構(gòu)異常，HB電泳是檢測異常Hb最常用的方法，但是本法只能對(duì)異常Hb位置初略定位，不能將其分到具體的變異名。而wHPLC根據(jù)出峰時(shí)間能很好定位出變異名（eg：G-Chinese，Q-Tailand，J-Bangkok,等）。盡管MCV法有很好的敏感性，但只對(duì)部分變異HBE敏感，所以篩查變異Hb最好的方法還是Hb電泳及wHPLC驗(yàn)證。

3.2地貧基因攜帶者通常表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素血癥，若MCV<80fl和／或MCH<27pg，排除IDA及其它疾病引起的降低，則應(yīng)高度懷疑為地貧；輕型THAL的篩查,目前尚無統(tǒng)一的臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法。盡管當(dāng)前采用基因技術(shù)，特別是PCR及其相關(guān)發(fā)展技術(shù)，已成為較為普遍的Hb病基因診斷方法，但血紅蛋白分析仍然是當(dāng)前診斷Hb病重要和可靠的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

3.3通過4種方法的系統(tǒng)比較，本文認(rèn)為篩查Hb病患者首選方法是敏感性極高的MCV法與HB電泳聯(lián)合檢測有很好的篩查效能及準(zhǔn)確性，再結(jié)合wHPLC能極大提高β-Thal、α/β-Thal、變異HB（除HBK以外）的檢出效果，特別是HBH病患者若H的含量少或合并β-Thal時(shí)，在HB電泳無HBH區(qū)帶，但在wHPLC明顯出現(xiàn)HBH峰，減少漏診，提高了診斷。紅細(xì)胞脆性實(shí)驗(yàn)由于方法學(xué)限制，受多數(shù)因素影響（溶血、孕婦、IDA、手工操作，等），對(duì)靜止型及α-Thal合并IDA以及IDA樣本時(shí)存在一定的漏檢率[10]，還存在部分假陽性（15/9203），篩查效能差，不具備單獨(dú)應(yīng)用的臨床價(jià)值。建議最佳篩查HB病的初篩方法MCV法與HB電泳聯(lián)合檢測，有條件的醫(yī)院可以再結(jié)合HPLC，同時(shí)進(jìn)行Heinz小體試驗(yàn)（主要用于a地貧的鑒別），HB包涵體檢測（診斷HbH病的主要證據(jù)之一），從而進(jìn)行綜合分析，為臨床提供準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，預(yù)防杜絕重型地貧兒的出生。

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