段梅莉

【摘 要】本文對一門新興的用于新藥開發(fā)的組合化學(xué)技術(shù)進(jìn)行了簡要的歸納和總結(jié)。組合化學(xué)的高通量合成策略從合成方法學(xué)上歸納為三類方法:平行合成法、裂分合成法、集組式合成。并概括介紹了高通量合成的重要輔助因子固相載體技術(shù)和自動(dòng)化技術(shù)。

【關(guān)鍵詞】組合化學(xué) 高通量合成 新藥開發(fā)

【中途分類號(hào)】O621.3 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-8209(2009)11-0-03

20世紀(jì)80年代末興起的組合化學(xué)技術(shù)在新藥開發(fā)的過程中,在先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)優(yōu)化上取得了卓有成效的研發(fā)結(jié)果。組合化學(xué)所運(yùn)用的高通量合成技術(shù)與傳統(tǒng)的有機(jī)合成有顯著的不同。如圖1所示,一般有機(jī)合成方法每次合成得到一個(gè)產(chǎn)物。高通量合成技術(shù)則是進(jìn)行組合合成,用一個(gè)構(gòu)建模塊A與另一個(gè)構(gòu)建模塊B的n個(gè)單元同時(shí)進(jìn)行一步反應(yīng),可以得到n個(gè)產(chǎn)物。用一個(gè)構(gòu)建模塊A的m個(gè)單元與另一個(gè)構(gòu)建模塊B的n個(gè)單元同時(shí)進(jìn)行一步反應(yīng),則得到m×n個(gè)化合物;若進(jìn)行Y步反應(yīng),則得到n×n×Y或m×n×Y個(gè)化合物。有人作過統(tǒng)計(jì),一個(gè)化學(xué)家用組合合成在2～6周完成的工作量,相當(dāng)于十個(gè)化學(xué)家用傳統(tǒng)方法花費(fèi)一年時(shí)間才能合成得到的化合物數(shù)目。由此可見,高通量合成大幅度提高了新化合物的合成效率,減少了時(shí)間和資金的消耗,成為繼20世紀(jì)末至今化學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

高通量合成可以分為固相組合合成和液相組合合成兩大類,組合化合物庫也相應(yīng)的分類為固相庫和液相庫。因此庫化合物的合成策略應(yīng)當(dāng)圍繞著這二大類組合合成展開進(jìn)行。高通量合成從合成方法學(xué)上來說,可歸納為以下三種方式:平行合成法;裂分合成法;集組式合成。

1 平行合成法(Parallel synthesis)

也稱間隔平行式合成。間隔平行式合成的基本原理是一孔一化合物。與傳統(tǒng)有機(jī)合成的原理相似,通過空間隔開的整齊排列的反應(yīng)器皿來平行合成化合物。由于在特定區(qū)域可得到很純的化合物,因此化合物結(jié)構(gòu)測定容易,參數(shù)相對容易取得。該方法的特點(diǎn)是合成速度較快、化合物數(shù)目較大,可用于固相組合合成和液相組合合成中。平行合成法多使用96孔微量滴定板操作。平行合成法已成功用于抗菌化合物和神經(jīng)激肽-2拮抗劑類似物等化合物庫的制備。

當(dāng)化合物庫有許多生物活性化合物供篩選時(shí),使用平行合成法最適合。因?yàn)槠叫泻铣煞ê铣傻幕衔锸且豢滓换衔?單個(gè)化合物對新藥開發(fā)中先導(dǎo)化合物優(yōu)化和構(gòu)效關(guān)系研究(SAR)特別有價(jià)值。平行液相合成和平行固相合成均可快速、高效的合成出對應(yīng)大量單個(gè)化合物的液相庫和固相庫。固相庫的合成產(chǎn)量可以從納摩爾到毫摩爾不等,一般來說液相庫的產(chǎn)量較固相庫高?；衔飵烊萘吭趲浊б陨蠒r(shí),多采用自動(dòng)化裝置進(jìn)行合成。

1.1 多針法(Polypin)

也稱多中心合成法,它是Geyson教授發(fā)明的用于多肽合成的一種96孔微量滴定板反應(yīng)裝置。該裝置每孔對應(yīng)使用長40mm,直徑4mm的聚乙烯小棒(針)固定在滴定板上進(jìn)行操作。每個(gè)小棒承載的化合物量在100納摩爾-50微摩爾不等,可合成超過25mg的產(chǎn)物。這種多針合成反應(yīng)裝置已成功地用于口蹄疫病毒抗原體的免疫學(xué)研究上。

多針合成法的具體操作是,將浸在丙烯酸水溶液中的聚乙烯(PE)或聚丙烯(PP)小棒用γ射線照射,使針的表面活化?；罨蟮尼槺霍然采w。這些羧基與長鏈的結(jié)合分子連接后,就提供了既能增加反應(yīng)體系流動(dòng)性又可以連接構(gòu)件的氨基基團(tuán)。把不同的氨基酸溶液反應(yīng)試劑移到96孔微板的每個(gè)孔中,即可對每一根針進(jìn)行獨(dú)立的合成反應(yīng)。在每步反應(yīng)完成后將小棒移開,在一個(gè)公共反應(yīng)器中對這些小棒同時(shí)進(jìn)行樹脂珠的沖洗等純化操作。重復(fù)這些操作直至拿到理想化合物。對應(yīng)小棒上的目標(biāo)產(chǎn)物可通過切割分離到滴定板的每個(gè)孔中,就使得每個(gè)孔均含有一個(gè)單獨(dú)的化合物。使用連在針上的多肽進(jìn)行生物活性測定時(shí),可與多種靶分子進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn),操作可反復(fù)進(jìn)行多達(dá)幾十次。

多針合成法是一種有效平行合成多肽的方法,尤其是以羧基或酰胺結(jié)尾的多肽。該法也可用以合成苯并二氮雜窧類有機(jī)小分子化合物庫。目前該技術(shù)正向著高負(fù)載量、多種官能團(tuán)化的固相載體材料以及多樣性豐富的化學(xué)反應(yīng)方向發(fā)展。在先期為抗原位點(diǎn)研究進(jìn)行的多肽合成中,多針合成法產(chǎn)生了非常大的影響,已成為最有價(jià)值的組合化學(xué)合成技術(shù)的標(biāo)志。

1.2 茶葉袋法(Tea-bag)

茶葉袋法是Houghten教授1986年發(fā)明的一種組合合成技術(shù)。該技術(shù)自使用以來,對探明激素分子活性片段有關(guān)的構(gòu)效關(guān)系研究、對蛋白質(zhì)片斷構(gòu)象的探察以及對RGD肽類似物的深入研究都顯示了很大的功效。

該方法的固相載體為常見的Merrifield聚苯乙烯樹脂,反應(yīng)容器為化學(xué)惰性的多孔PE小袋,袋子的大小尺寸約為15mm×22mm,茶葉袋網(wǎng)眼74um,可防止樹脂珠漏出,保證溶劑等可溶性物質(zhì)的出入。為了高通量合成大容量的多肽庫,節(jié)省時(shí)間和工作量,在相同的化學(xué)反應(yīng)步驟中,每一個(gè)反應(yīng)器內(nèi)可容納多個(gè)袋子,同時(shí)進(jìn)行相同的反應(yīng),集中進(jìn)行洗滌、脫保護(hù)和中和。再集中切除樹脂珠。根據(jù)茶葉袋的尺寸和樹脂珠的質(zhì)量,化合物庫每個(gè)產(chǎn)物的產(chǎn)量大約為7-15mg,多的可達(dá)100mg。使用這種集中進(jìn)行共同反應(yīng)步驟的方法,在制備肽庫時(shí)大大提高了合成效率,使之成為組合合成的典型范例。

1.3 點(diǎn)陣法

該法是以纖維素紙片作為固相載體的合成技術(shù)。以纖維素為基質(zhì)的紙片具有多孔性和極性,可在篩選時(shí)避免出現(xiàn)非特異性蛋白結(jié)合的副作用。但其缺點(diǎn)是不耐受強(qiáng)酸環(huán)境,僅適合Fmoc保護(hù)方式的構(gòu)件。該合成反應(yīng)操作簡便,雖無制備意義,但其合成技巧可以與嫁接多針掃描法及超大規(guī)模固定化多肽合成技術(shù)相媲美。點(diǎn)陣法多肽庫的合成已用于對人體巨細(xì)胞病毒蛋白抗原決定簇的定位試驗(yàn)。

點(diǎn)陣法斑點(diǎn)合成技術(shù)操作是,控制所用試劑的體積,選擇斑點(diǎn)的位置,使斑點(diǎn)布滿一張紙面而又不發(fā)生重疊。這些斑點(diǎn)對應(yīng)不同的多肽,可以用鉛筆標(biāo)記斑點(diǎn)。將結(jié)合分子接到紙上后,對每個(gè)斑點(diǎn)滴加相應(yīng)高濃度的氨基酸活化酯溶液,經(jīng)洗滌-脫保護(hù)-再洗滌處理,完成一個(gè)構(gòu)件的縮合。如此反復(fù)操作進(jìn)行多肽的合成。用溴酚藍(lán)指示劑給紙片染色,通過觀察由藍(lán)到黃的顏色變化(游離的氨基被?；?來跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。

1.4 光印法(Light-directed parallel synthesis)

也稱超大規(guī)模固定化多肽合成(very large scale immobilized peptide synthesis, VLSIPS)。光印法是將固相合成技術(shù)與光敏式印刷技術(shù)結(jié)合為一體的一種高通量合成方法。它是平行合成中較為特殊的一種方法,其關(guān)鍵技術(shù)是對光不穩(wěn)定的保護(hù)基通過特殊位置的光照會(huì)選擇性的斷裂。該法可以在一張50um2的玻璃載片上合成出容量高達(dá)5萬的多肽或寡聚核苷酸的化合物庫。并且每種特定產(chǎn)物序列占據(jù)空間的一個(gè)特定區(qū)域。由于篩選是連在載體上進(jìn)行,經(jīng)熒光顯色篩選識(shí)別出有生物活性化合物的結(jié)構(gòu),可由其所在位置得到確認(rèn),合成十分精確。該合成技術(shù)已用于內(nèi)啡肽的抗體合成篩選試驗(yàn)。

2 裂分合成法(split-poll synthesis)

亦稱混合-裂分式合成、一珠一化合物(one-bead one-product, OBOP)。裂分合成法是最早也是至今應(yīng)用最廣泛的一種高通量組合合成技術(shù)。該法只需幾個(gè)反應(yīng)器即可構(gòu)成一個(gè)容量龐大的化合物庫,是合成大量不同化合物最常用的方法。裂分合成技術(shù)為藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了充足的化合物資源,改變了傳統(tǒng)的單一合成/單一篩選的藥物研究格局。

裂分合成法只需幾個(gè)反應(yīng)器就可以產(chǎn)生一個(gè)化合物庫,圖2例示了三個(gè)構(gòu)建單元通過三步反應(yīng)的裂分合成。具體操作是,將固相載體樹脂珠分成數(shù)目相等的三部分,每一部分放在單獨(dú)的反應(yīng)器中,各部分獨(dú)自與不同的構(gòu)建單元A、B和C反應(yīng),這樣每一個(gè)樹脂珠就連接上了一個(gè)構(gòu)建單元。當(dāng)?shù)谝徊椒磻?yīng)完成后,將每個(gè)反應(yīng)器中的樹脂珠分成數(shù)目相等的三部分,并混合每一個(gè)反應(yīng)器中的樹脂珠成均等的三部分,爾后集中在一個(gè)器皿中進(jìn)行常規(guī)的沖洗和脫保護(hù)程序。然后將每一部分樹脂珠放在單獨(dú)反應(yīng)器中獨(dú)自與不同的構(gòu)建單元A、B和C反應(yīng),這樣每一個(gè)樹脂珠就連接上了第二個(gè)構(gòu)建單元。如此反復(fù)直至庫容量達(dá)到了33=27個(gè)化合物。

裂分合成法合成的特點(diǎn)是OBOP,即每一個(gè)樹脂珠都連有一個(gè)單獨(dú)的化合物。因此,該法的組合化合物庫又稱為一珠一化合物庫。裂分合成法制得的化合物庫中產(chǎn)物的數(shù)目以幾何級(jí)數(shù)增長,N=bx(N為庫容量;b為構(gòu)建單元數(shù);x為合成步驟數(shù))。

用高效的編碼技術(shù)輔助進(jìn)行裂分合成時(shí),可以幾個(gè)小圓柱形反應(yīng)器為混分操作的基礎(chǔ)單元,每一個(gè)反應(yīng)器由微孔外壁將幾百粒樹脂珠和射頻記錄片包在其中,在合成反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí)輸入該構(gòu)件單元的射頻信號(hào)。因此合成完成后,通過解讀記錄片上的信號(hào)即可識(shí)別反應(yīng)器內(nèi)連在樹脂珠上的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)信息。每一個(gè)反應(yīng)器內(nèi)的所有樹脂珠上均連著同一產(chǎn)物,這樣得到的化合物庫稱其為一反應(yīng)器一化合物庫,即OVOP(one-vessel one-product)庫。

裂分合成法合成的庫化合物的生物活性篩選可以直接用樹脂珠上的化合物測試活性,更可靠的方法是用固相載體上切下的混合物溶液來測試。解纏繞過程是常用的一種對混合裂分合成化合物庫進(jìn)行生物活性篩選的方法和手段。

3 集組式合成(pooling synthesis)

也稱混合試劑合成法。集組式合成的特點(diǎn)是對全部構(gòu)件進(jìn)行有序排列并按一定形式編組。每一組含有多種不同的構(gòu)件,一組作為一種構(gòu)建單元投入合成。庫化合物組合合成的每一步反應(yīng)都是在構(gòu)建單元混合物的反應(yīng)器皿中進(jìn)行。固相集組式合成得到的不是一珠一化合物庫,而是一珠一組甚至是一珠多組化合物庫。液相集組式合成得到的化合物庫,可以按組分布,每一組均含多種化合物。不管是固相庫合成還是液相庫合成,兩者都需要高效的編碼技術(shù)輔助進(jìn)行,以備在其后的生物篩選中它們的結(jié)構(gòu)信息得到及時(shí)的識(shí)別。

集組式合成可歸納為正交編組法、索引編組法以及模板核心法三種形式的操作過程。集組式合成是發(fā)現(xiàn)藥物先導(dǎo)化合物最經(jīng)濟(jì)的方法。該方法實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低,不必逐一合成組合庫中各個(gè)單組分,一般的實(shí)驗(yàn)室即能進(jìn)行合成操作。雖然該法簡易可行,但缺點(diǎn)也明顯,即組分越多,分析跟蹤及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)識(shí)別的難度越大。

4 固相載體技術(shù)

固相合成技術(shù)是高通量合成的核心內(nèi)容,該技術(shù)從20世紀(jì)60年代被Merrifield創(chuàng)造性地成功合成多肽以來,便得到了極大的重視。在國際醫(yī)藥企業(yè)的合力運(yùn)作下,1990年代至今固相合成技術(shù)得到了蓬勃發(fā)展,基本形成了固相有機(jī)合成化學(xué)的獨(dú)立學(xué)科。而且固相合成技術(shù)遠(yuǎn)未成熟,被認(rèn)為仍有極大的發(fā)展空間,現(xiàn)在的成果只是金山一角。有統(tǒng)計(jì)表明,與有機(jī)化學(xué)相關(guān)的排名前15位的國際期刊幾乎每一期均刊登與固相有機(jī)合成相關(guān)的論文。固相合成技術(shù)最基本的構(gòu)成要素就是固相載體。因此固相載體技術(shù)可以說是固相庫合成的基石。

4.1 功能樹脂

固相載體是在各種溶劑中不溶解但可溶漲的高聚物材料,即功能樹脂。高通量合成要求載體具有一定的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度;能夠與結(jié)合分子相連,但對庫合成中使用的反應(yīng)條件惰性,在需要時(shí)隨時(shí)方便斷開;能夠在結(jié)合分子上延續(xù)化合物的制備,延續(xù)的合成步驟不破壞載體,也不影響其它化學(xué)鍵。

隨著高分子材料的發(fā)展,基于交聯(lián)聚苯乙烯(PS)的高強(qiáng)度Merrifield樹脂、在極性非質(zhì)子溶劑中溶解度高,官能團(tuán)保護(hù)、脫保護(hù)和切割條件更加溫和的聚酰胺樹脂以及可在水相中進(jìn)行合成、對酶學(xué)研究意義重大的TentaGel(PS-PEG copolymer)樹脂等各類功能性樹脂材料被先后開發(fā)出來。任何功能樹脂均可以按合成的要求制成固相載體。固相載體從外形上可以分為樹脂珠、多針和薄片。

4.2 樹脂珠技術(shù)(bio-bead)

絕大多數(shù)的固相庫合成是通過樹脂珠技術(shù)來實(shí)施的。1g樹脂可以制成幾百萬個(gè)樹脂珠,按照“三倍多余”的原則,可以構(gòu)建一個(gè)10萬個(gè)產(chǎn)物的化合物庫。每個(gè)樹脂珠的直徑大約為100?m,可承載200pmol的化合物。樹脂珠的制備方法是,向單體有機(jī)相和交聯(lián)劑的混合水溶液中加入自由基引發(fā)劑,升溫啟動(dòng)聚合反應(yīng),將微小液滴轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w球狀小珠子顆粒。其聚合反應(yīng)的要點(diǎn)是保證小珠體積均一。運(yùn)用平行合成法、裂分合成法進(jìn)行的組合合成均可得到每一個(gè)樹脂珠都連有一個(gè)單獨(dú)化合物的一珠一化合物庫,即OBOP(one-bead one-product)庫。

4.3 薄片技術(shù)(thin tag)

任何一種能在樹脂珠上進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)均能在薄片上實(shí)施合成反應(yīng)。用PS樹脂制成的形似小餅干的薄片(chip),如四邊形、三角形、圓形、五角形和六角形的小薄片,它們有一定的強(qiáng)度和許多微孔,且有良好的溶脹性。由于較大的表面積,產(chǎn)物的上載量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于一粒樹脂珠,因此較有制備意義。運(yùn)用裂分合成法組合合成可得到每片薄片上有一種產(chǎn)物的化合物庫,即OCOP(one-chip one-product)庫。

基于紙片的薄片可作為點(diǎn)陣法平行合成的載體。而基于玻片的薄片可作為光印法平行合成的載體。

4.4 固相膜技術(shù)

基于高聚物的薄片比紙片的化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定,因而可以承受更寬的化學(xué)反應(yīng)條件范圍。聚氟乙烯膜制成的高聚物薄片的點(diǎn)合成,其合成方法與紙片斑點(diǎn)技術(shù)相似,將膜表面用乙二胺衍生化后,便提供了帶有氨基的活化基團(tuán)表面。將有Fmoc保護(hù)的丙氨酸活化酯溶液以規(guī)則的空間排布方式點(diǎn)到固相膜上,就得到了用于多肽合成的斑點(diǎn)。在點(diǎn)合成偶聯(lián)步驟之間,膜可被多次晾干-洗滌-再晾干,用哌啶溶液脫Fmoc保護(hù),多肽的多種產(chǎn)物就集合在一張薄片上。

還有一種固相膜三明治合成技術(shù),是將兩張PP小片夾住樹脂珠,像三明治一樣,用一種低熔點(diǎn)的聚合物使珠子在膜操作及整個(gè)合成步驟中固定不動(dòng)。運(yùn)用裂分合成法組合合成可得到每張層狀載片上有一種產(chǎn)物的化合物庫,即OSOP(one-slide one-product)庫。由于每一張層狀載片上含有許多樹脂珠(可達(dá)幾千粒),則每一種產(chǎn)物的量相對較高,因此OSOP庫合成具有制備意義,比OBOP庫合成實(shí)用性高。

5 自動(dòng)化合成技術(shù)

隨著生物化學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展,每天可篩選上萬個(gè)化合物生物活性的高通量篩選技術(shù)已經(jīng)被廣泛運(yùn)用。當(dāng)組合化合物庫容量達(dá)到上千的規(guī)模時(shí),在有限的時(shí)間里,完成人工合成和對生物靶點(diǎn)的篩選是一項(xiàng)十分艱巨的工作。因此庫化合物的自動(dòng)化高通量合成技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生,可以說這是為了跟上高通量篩選的步伐,而產(chǎn)生的一種快速、高效的合成技術(shù)。與該技術(shù)相配合,需要機(jī)器來完成的操作有,樹脂珠裝載、試劑的轉(zhuǎn)移、合成條件的控制、合成反應(yīng)的進(jìn)行、化合物的分離、純化和結(jié)構(gòu)分析以及樹脂珠的切割等。顯然自動(dòng)化高通量合成技術(shù)是一項(xiàng)繁雜有序的過程工程,它將有機(jī)化學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及信息和電氣自動(dòng)化技術(shù)等多學(xué)科集于一體。

組合化學(xué)需要合成大量毫克級(jí)量的化合物來篩選。該特點(diǎn)使得利用高效小型機(jī)件和器械來處理大量樣品,成為節(jié)約省時(shí)最基本的前提。固相庫的平行合成法組合合成是自動(dòng)化高通量合成技術(shù)取得成功運(yùn)營的一個(gè)范例。滴定機(jī)器人等自動(dòng)化機(jī)件被廣泛的使用在許多合成操作上。已知多肽和核酸的組合合成,目前已經(jīng)完全可以用自動(dòng)平行合成儀來進(jìn)行操作。但是自動(dòng)化高通量合成技術(shù)水平仍然低于發(fā)展較為完善的高通量篩選。平行合成自動(dòng)儀每天約產(chǎn)生1000～2000個(gè)化合物,而微量滴定板上的高通量篩選,可對特定的生物受體每天篩選1～5萬個(gè)化合物。

絕大多數(shù)的高通量合成是在10mg、10-20umol數(shù)量級(jí)的微反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行。微反應(yīng)器的普遍使用給組合合成和篩選策略帶來了根本的改變。微反應(yīng)器聯(lián)通了合成和篩選的直接整合,也提供了發(fā)現(xiàn)新藥化合物的更好方法。微反應(yīng)器與微尺度純化和高靈敏度分析設(shè)備緊密相連,毫微托板用于從微流量分離單元中直接收集樣品,直接轉(zhuǎn)移到生物分析單元。這樣整合的成套設(shè)備,使化合物合成后就用來篩選,設(shè)備中沒有儲(chǔ)存系統(tǒng)。

6 結(jié)束語

以上對新興的用于新藥開發(fā)的組合化學(xué)技術(shù)進(jìn)行了簡要的歸納和總結(jié)。組合化學(xué)的高通量合成策略從合成方法學(xué)上可以歸納為三類方法:平行合成法、裂分合成法、集組式合成。本文還概括介紹了高通量合成的重要輔助因子固相載體技術(shù)和自動(dòng)化技術(shù)。相信在不久的將來,最早用于新藥開發(fā)的高通量合成技術(shù)在我國相關(guān)的研發(fā)領(lǐng)域能得到較大的普及應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] 吉民.組合化學(xué),北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004.

[2] 王德心.固相有機(jī)合成,北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004.

[3] 王德心..組合化學(xué)原理、技術(shù)及應(yīng)用,北京中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2005.

[4] Willi Bannwarth, et al, Combinatorial Chemistry, Weinheim, WILEY-V.