謝雪迎 任鵬飛 朱常香 宮志遠(yuǎn)

摘 要:采用拮抗試驗(yàn)和酯酶同工酶譜分析兩種生物學(xué)方法對(duì)24個(gè)香菇菌株進(jìn)行鑒定和分類,構(gòu)建樹狀圖。結(jié)果表明:拮抗試驗(yàn)受外界環(huán)境影響大,可用于香菇菌株的初步分類;酯酶同工酶譜帶豐富,可以完成香菇菌株的鑒定,在聚類圖譜0.84的水平上24個(gè)香菇菌株可以分為10大類。

關(guān)鍵詞:香菇;分類;拮抗;酯酶同工酶

中圖分類號(hào):S646.1+20.37 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2009)12-0036-04

香菇(Lentinula edoeds)是世界上最主要的食用菇類栽培品種之一,在食用菌的產(chǎn)量構(gòu)成中占有重要地位,1994～1995年世界食用菇類總產(chǎn)量達(dá)490×104 t,其中香菇占15%[1]。由于其味美質(zhì)嫩和具有增強(qiáng)人體免疫功能的特殊作用,香菇已成為全球性備受歡迎的功能食品。

我國是世界香菇栽培的起源地,從發(fā)明最原始的“砍花法”以來,迄今已有1 500多年的栽培歷史[2]。我國擁有世界上最豐富的香菇種質(zhì)資源,在香菇生產(chǎn)的三大要素(菌種、培養(yǎng)料、栽培管理)中,菌種是最重要的基礎(chǔ)生產(chǎn)資料,是影響香菇產(chǎn)量及質(zhì)量構(gòu)成的關(guān)鍵因子。我國香菇生產(chǎn)快速發(fā)展的主要原因之一,就是引進(jìn)和選育了一大批優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的菌種。由于目前香菇菌株同名異物和同物異名現(xiàn)象嚴(yán)重,故對(duì)香菇菌株進(jìn)行有效的分類和鑒定就成了香菇新品種選育的基礎(chǔ)和前提。本試驗(yàn)對(duì)24個(gè)香菇菌種通過拮抗和酯酶同工酶試驗(yàn)進(jìn)行了分類和鑒定,旨在為后來的選育工作提供依據(jù)[3]。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的香菇菌株見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗試驗(yàn) 挑取大米粒大小的兩菌株種塊于90 mm培養(yǎng)皿內(nèi)對(duì)峙培養(yǎng),種塊間距1.5～2.0 cm。每個(gè)菌株重復(fù)3次,于25℃培養(yǎng)20 d,觀察結(jié)果并拍照。

1.2.2 菌絲體培養(yǎng) 參考林芳燦的方法[4],將參試菌株在相同條件下接種于PDY液體培養(yǎng)基中進(jìn)行淺層培養(yǎng),培養(yǎng)量以各自可以做3個(gè)平行試驗(yàn)為準(zhǔn)。

1.2.3 同工酶分析 收集供試菌株菌絲體各3份,液氮研磨。將研磨后的樣品在4℃、10 000 r/min離心10 min,取其上清液。將上清液、蔗糖溶液和溴酚藍(lán)指示液按5∶1∶1的體積比混合作為電泳樣品。經(jīng)SDS-PAGE電泳,取分離膠染色,拍照。

1.2.4 試驗(yàn)結(jié)果的觀察和統(tǒng)計(jì)分析 觀察樣品酶帶的位置,計(jì)算每條酶帶的相對(duì)遷移率(Rf)。Rf按下列公式計(jì)算:

Rfn=d璶/d

式中:Rfn為條帶n的相對(duì)遷移率;d璶為條帶n的遷移距離(cm);d為溴酚藍(lán)的遷移距離(cm)。

同時(shí)將凝膠照相存圖。根據(jù)菌株每條酶帶的出現(xiàn)與否,計(jì)算各菌株間的遺傳相似系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗試驗(yàn)

24個(gè)香菇菌株共設(shè)計(jì)拮抗組合276組,拮抗現(xiàn)象不明顯的有25組,占9.1%,其中L26與中香1號(hào)、香66-2、856、50826沒有拮抗,親緣關(guān)系較近;SNL23與HW021、SNL8、香62親緣關(guān)系較近;中香1號(hào)與獅子頭、野生香菇親緣關(guān)系較近;香939與中香2號(hào)、日大親緣關(guān)系較近。其它組合的11個(gè)菌株拮抗現(xiàn)象比較明顯。因而拮抗試驗(yàn)結(jié)果可將24個(gè)香菇菌株初步分為14類(圖1、表2)。

2.2 酯酶同工酶譜分析

提取24個(gè)香菇菌株的酯酶同工酶進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳,共得到73條譜帶,各菌株譜帶1～5條不等,相對(duì)遷移率介于0.29～0.92之間(見表3)。各菌株間譜帶的深度和寬度有明顯差異,寬且深的譜帶說明酶含量高,活性大;窄且淺的表明酶含量低,活性小。根據(jù)譜帶的深淺和寬窄,可將所有譜帶分為四級(jí):一級(jí)酶帶色深帶寬;二級(jí)酶帶色較深而寬;三級(jí)酶帶色較淺而窄;四級(jí)酶帶色淺而窄(圖2)。

2.3 聚類分析

根據(jù)酯酶同工酶電泳結(jié)果,將同一相對(duì)遷移率位置上有條帶記為1,無條帶記為0,構(gòu)建矩陣并用NTSYS進(jìn)行分析[5]。聚類分析結(jié)果(圖3)表明,所有參試菌株在0.68的相似水平上可以歸為一類,在1.00水平上歸為22類,變異范圍為0.68～1.00。在1.00水平上,9015和9508、獅子頭和申香10號(hào)相似系數(shù)很高,可認(rèn)為是一個(gè)菌株。在0.84水平上分為10大類,其中136.3、856、泌陽3、SNL8、古香66、中香1號(hào)各成一類;香62、閔豐1號(hào)、9508和9015歸為一類;SNL23、野生香菇、HW021、秋栽6號(hào)、香菇939、50826歸為一類;日大、高溫香菇、香66-2歸為一類;申香10號(hào)、獅子頭、中香2號(hào)、L26、241-4歸為一類。

3 結(jié)論與討論

與生化標(biāo)記、分子生物學(xué)標(biāo)記相比,拮抗試驗(yàn)結(jié)果主觀性強(qiáng),菌絲生長(zhǎng)狀況受外界環(huán)境的影響很大,往往使觀察結(jié)果與其它鑒定手段相悖。本試驗(yàn)中,在沒有拮抗線的試驗(yàn)組合中,也能觀察出菌絲生長(zhǎng)狀況的明顯不同,這說明其菌株遺傳背景差異還是有的,只不過沒有在平板上顯現(xiàn)出來而已。所以拮抗試驗(yàn)只能用于菌株的初步分類。

在生化標(biāo)記中,酯酶同工酶的穩(wěn)定性最好,是目前菌種鑒定的常用方法。但酯酶同工酶的測(cè)定對(duì)培養(yǎng)條件的一致性要求較高,并且不同菌株、不同發(fā)育時(shí)期、不同部位的酶譜也不一致[6]。故所有處理必須具備相同的培養(yǎng)條件和提取條件,才能保證酶譜分析的客觀性。本試驗(yàn)中,香菇共同性譜帶不清楚,可能與提取條件有關(guān)。

聚類分析通過酶譜條帶的有無構(gòu)建矩陣,并利用NTSYS軟件繪制樹狀圖、計(jì)算相關(guān)系數(shù)。但在多大的遺傳系數(shù)上進(jìn)行分類最為合理,需要進(jìn)一步的研究。本試驗(yàn)的遺傳系數(shù)介于0.68～1.00之間,所取的分類點(diǎn)為0.84,是兩者的平均數(shù)。

參 考 文 獻(xiàn):

[1] Chang shu-ting.Mushroon Biology and Mushroon Products[M].Chinese University press,1997,1-10.

[2] 楊新美.中國食用菌栽培學(xué)[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1988,292-294.

[3] 呂作舟,劉巧云.我國香菇育種的回顧與展望[J].中國食用菌,1996,15(1):5-6.

[4] 林芳燦,高國琪.香菇主要數(shù)量性狀遺傳率及相關(guān)性研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1993,12(1):27-30.

[5] 蓋均鎰.試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2000,35-46

[6] 王 鐳,張 婤,潘迎捷,等.利用方差分析和聚類分析法進(jìn)行香菇種質(zhì)資源評(píng)價(jià)[J].食用菌學(xué)報(bào),1997,4(3):21-24.