康 玲

摘 要:以百子蓮(Agapanthus africanus)的根莖部和葉片為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng),以MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,附加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)根莖部直接再生不定芽;同時(shí)以百子蓮幼嫩葉片和種子進(jìn)行組織培養(yǎng)作對比試驗(yàn)。結(jié)果表明,成熟的根莖接種在添加BA 4.0mg/L 和NAA 0.1mg/L 的MS培養(yǎng)基上不定芽分化率達(dá)最高,平均外植體不定芽個(gè)數(shù)在10個(gè)以上。將葉片分別接種到添加不同濃度2,4-D和MS+BA 4.0mg/L+NAA 0.1mg/L的培養(yǎng)基中,結(jié)果沒有誘導(dǎo)出不定芽。誘導(dǎo)百子蓮生根實(shí)驗(yàn)表明IBA對百子蓮的生根沒有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞:百子蓮;離體培養(yǎng);根莖

百子蓮又名非洲百合,是石蒜科、百子蓮屬植物。產(chǎn)于南非,為一庭園花卉,廣州和北京有栽培。與花名相符的藍(lán)紫色或白色花朵浪漫誘人,細(xì)細(xì)的筒狀花向四周綻放,似高貴而優(yōu)美的女性,由于歐洲人偏愛藍(lán)紫色系,故英國園林中栽培極廣,近些年來在世界各國被廣泛應(yīng)用于切花生產(chǎn)、園林美化、藥用成分提取等方面。我國引入百子蓮屬植物的時(shí)間不長,科研成果缺乏,對其組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)還未見報(bào)道。百子蓮是以分株和播種為現(xiàn)階段最主要的繁殖方式,但繁殖的速度慢,時(shí)間長。目前為了加快百子蓮的繁殖速度,縮短繁殖的周期,對百子蓮進(jìn)行離體培養(yǎng),可以大量且快速地進(jìn)行繁殖。同時(shí),對百子蓮的離體培養(yǎng),建立高效穩(wěn)定的離體再生體系,為百子蓮的分子育種提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

本研究為百子蓮的組織培養(yǎng)的初步研究,對百子蓮不同的外植體進(jìn)行參照培養(yǎng),參考了火焰衛(wèi)矛生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 012mg/L。試驗(yàn)最后得到一些初步結(jié)果,為百子蓮的離體快繁、無病毒苗木培育等奠定基礎(chǔ),豐富了自身基礎(chǔ)理論,并且在實(shí)際生產(chǎn)中也會(huì)提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1無菌外植體材料的獲得

以2008年9月在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園采收的百子蓮(品種A. praecox ssp. minimus ‘Storms River)飽滿種子為實(shí)驗(yàn)材料。將所取材料先用清水沖洗干凈,在超凈工作臺上用70%的酒精消毒30秒,再用0.1%升汞溶液消毒種子3分鐘,最后用無菌水沖洗3~4次。將消毒完畢的種子接種于沒有附加任何植物激素的培養(yǎng)基,約1周后種子膨大發(fā)芽,2~3周時(shí)將幼苗的根系從根頸處切掉,切取根頸及葉片用于不定芽的誘導(dǎo)。

1.2不定芽的再生

將切掉根系的小苗及葉段(長1cm),接種到含不同植物激素濃度及組合的MS培養(yǎng)基上(激素配比見表2),所有培養(yǎng)基中均附加3%蔗糖及0.6%瓊脂,調(diào)節(jié)pH 5.8~6.1,121℃條件下高溫蒸氣滅菌15 分鐘。每個(gè)處理最少接種50個(gè)外植體,重復(fù)3次。接種6周后統(tǒng)計(jì)不定芽分化率及外植體平均不定芽個(gè)數(shù)。

1.3葉片愈傷組織的誘導(dǎo)

將葉片切成長約1cm的小段接種在MS附加不同濃度2,4-D(表3)的培養(yǎng)基上,以誘導(dǎo)愈傷組織。

1.4再生苗的生根

當(dāng)不定芽長到3cm左右時(shí),從基部切割下來,轉(zhuǎn)接到附加不同濃度IBA的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)其生根率并觀察其根系的生長狀況。

1.5培養(yǎng)條件

所有培養(yǎng)均在以下條件下進(jìn)行:溫度25±2℃,光照強(qiáng)度:1500~2000Lx,光照時(shí)間:14 小時(shí)光照,10 小時(shí)黑暗。

2 結(jié)果與分析

2.1無菌苗的獲得

將經(jīng)過消毒的百子蓮種子放入MS基本培養(yǎng)基中,約5天開始膨大,再過約20天長成2~3cm的小苗。由表1可知,該品種發(fā)芽率比較高,但發(fā)芽不整齊,接種的第7天,只有少量的種子萌發(fā),隨著發(fā)芽時(shí)間的延長,發(fā)芽率逐漸提高,當(dāng)接種3周左右時(shí),其發(fā)芽率達(dá)到最高,為90%。出現(xiàn)此種情況可能和種子的飽滿度有一定的關(guān)系,在以后的實(shí)驗(yàn)中還需加強(qiáng)對種子整齊度的進(jìn)一步篩選。

2.2不定芽分化的形態(tài)觀察

本研究中以根莖和葉片為外植體,但只有以根莖外植體的誘導(dǎo)中形成了不定芽,以葉片為外植體,沒有愈傷組織形成,也沒有不定芽。當(dāng)根莖外植體接種2周后,其基部開始膨大,接種3周時(shí)有大量白色愈傷組織形成,接種4周時(shí),有少量不定芽開始出現(xiàn),繼續(xù)培養(yǎng)至6周時(shí),有大量不定芽開始形成。伴隨不定芽大量形成,也有葉片生成。

2.3不同外植體、不同激素及濃度配比對不定芽形成的影響

將百子蓮根莖和葉片接種于附加不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)。由表2可知,不同外植體的不定芽再生能力有很大差異。不同濃度的KT和NAA組合根莖、葉片為外植體均沒有不定芽的形成。但不同濃度的BA與0.1mg/L NAA結(jié)合,均有愈傷組織及不定芽的形成,當(dāng)BA濃度為1.0 mg/L時(shí),其不定芽再生率僅為39%,外植體平均不定芽數(shù)只有4個(gè),生成2~3片葉;隨著BA濃度的提高,不定芽的再生率快速上升;當(dāng)BA濃度為4.0mg/L時(shí),不定芽的再生率達(dá)到最高,為95%,一般生成5~7片葉,外植體平均不定芽數(shù)目也達(dá)到最多,大多在12個(gè)以上;但當(dāng)BA濃度再增加時(shí),不定芽的再生率及外植體平均不定芽數(shù)目反而均有所下降,因此4.0 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA是百子蓮不定芽最佳的誘導(dǎo)體系。

2.4葉片愈傷組織誘導(dǎo)

以百子蓮的葉片為外植體接種在含有不同濃度的細(xì)胞分裂素和生長素的培養(yǎng)基上,沒有不定芽的形成,也沒有出現(xiàn)愈傷組織。為了建立以葉片為外植體的再生體系,試驗(yàn)中再次以2,4-D作為主要生長調(diào)節(jié)劑來誘導(dǎo)愈傷組織的形成。本研究將細(xì)嫩的葉片切成約1 cm長的小段,接種到含不同濃度2,4-D(1mg/L, 2 mg/L, 4 mg/L和8 mg/L)的培養(yǎng)基中,但是各處理均沒有任何反應(yīng)(數(shù)據(jù)略),可見百子蓮的葉片對植物激素的反應(yīng)極不敏感,因此,還有必要進(jìn)一步研究以葉片為外植體,其愈傷組織和不定芽再生所需的最佳條件。

2.5不定芽生根誘導(dǎo)

當(dāng)根莖上再生的不定芽長到約3cm時(shí),將其從基部切下轉(zhuǎn)入附加不同濃度IBA(0.5 mg/L、1.0 mg/L和2.0 mg/L)的生根培養(yǎng)基中,誘導(dǎo)其生根(表3)觀察發(fā)現(xiàn),接種30 天時(shí),各處理中依然沒有不定根形成,可見IBA對百子蓮的生根沒有促進(jìn)作用,其最佳的生根體系還有待于進(jìn)一步研究。

3討論

目前有關(guān)百子蓮近緣植物再生體系的研究有:朱頂紅(Hippeastrum)藍(lán)百合(Praeco ssp.orientalis ‘Big Blue)唐菖蒲(Gladiolus),研究表明,不同種間對外源植物激素誘導(dǎo)效應(yīng)明顯不同。本試驗(yàn)初步成功建立了百子蓮根莖離體再生體系,并發(fā)現(xiàn)百子蓮根莖離體再生受許多內(nèi)外因素的影響。外部因素如培養(yǎng)基成分、植物激素的濃度及配比等對不定芽的分化影響不同,其中激素的種類和濃度尤為重要。如添加NAA+BA的培養(yǎng)基和添加KT培養(yǎng)基上的根莖有明顯的差別:添加NAA+BA的培養(yǎng)基無論是愈傷組織誘導(dǎo)率還是芽誘導(dǎo)率都明顯高于添加KT培養(yǎng)基。內(nèi)部因素如植株的基因型、年齡、外植體的種類、生理狀態(tài)及大小等均影響植株的再生。一般供體植株年齡小、發(fā)育階段年幼的外植體容易再生植株。百子蓮不同部位通過離體培養(yǎng)最后結(jié)果各不相同:根莖部愈傷組織誘導(dǎo)率很高,葉片愈傷組織誘導(dǎo)率為0,也沒有不定芽出現(xiàn),分析認(rèn)為,可能是百子蓮的葉片對植物激素的反應(yīng)比較遲鈍,也可能是我們的試驗(yàn)組合較少,因此,還有必要對其再生所需要的條件進(jìn)一步探索。

在本次誘導(dǎo)不定芽生根的實(shí)驗(yàn)中,使用的是IBA。許多研究證明,生長素是試管苗誘導(dǎo)生根最重要的影響因子,它對不定根的分化是必需的。生長素影響酶的活性,增加了原生質(zhì)透性,降低了原生質(zhì)粘性,使代謝活動(dòng)加快,核糖核酸合成加強(qiáng),這一系列重要生理生化變化有利于不定根的發(fā)生和生長。較常使用的生長素主要有IBA,NAA,IAA。其中NAA對生根的作用十分強(qiáng)大,其啟動(dòng)能力比IBA高3.7倍。IBA的作用雖弱,但不易被過氧化物酶分解,對生根有良好的效果。IAA在植物組織培養(yǎng)中使用的較少,因?yàn)橹参锝M織中存在吲哚乙酸氧化酶,專門氧化分解IAA,因此本研究中未用到IAA。不過使用IBA,百子蓮組培苗生根比較困難,三個(gè)不同濃度的處理均沒有形成不定根。因此,在隨后的試驗(yàn)中應(yīng)以多種生長素如AA、 IAA做為百子蓮生根的生長素進(jìn)行探索。

(收稿:2009-07-27)