蘇艷紅　王瑞元　周　越

摘要：目的在于探討低氧及低氧耐力訓(xùn)練條件下肌球蛋白重鏈（MHC）轉(zhuǎn)換的方式，了解低氧及低氧運(yùn)動(dòng)下骨骼肌微細(xì)組成的改變。方法：選取SD大鼠30只，隨機(jī)分為常氧對(duì)照組（NC）、低氧對(duì)照組（HC）和低氧訓(xùn)練組（HT）。HC組和HT組動(dòng)物均生活在模擬海拔4000米高度的低氧艙中，HT組進(jìn)行跑臺(tái)練習(xí)，28天后取淺層脛前肌。RT睵CR方法測(cè)定四種MHC亞型mRNA表達(dá)，SDS睵AGE方法測(cè)定各種MHC亞型蛋白表達(dá)。結(jié)果：低氧及低氧運(yùn)動(dòng)均使MHC－Ⅱa 蛋白表達(dá)顯著下降, MHC－Ⅱx和MHC－Ⅱb 蛋白表達(dá)顯著升高；低氧影響MHC基因表達(dá)為MHC－Ⅱa mRNA顯著升高，MHC－ⅠmRNA不顯著下降；低氧運(yùn)動(dòng)使MHC－Ⅱb mRNA顯著升高。結(jié)論：低氧及低氧訓(xùn)練使MHC蛋白和基因表達(dá)慢型向快型轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞：肌球蛋白重鏈；低氧；低氧運(yùn)動(dòng)

中圖分類號(hào)：G804.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-3612(2008)07-0919-03

低氧環(huán)境已顯示可引起骨骼肌形態(tài)學(xué)顯著的改變，如毛細(xì)血管密度增加、平均肌纖維橫截面積下降，同時(shí)線粒體數(shù)目、肌紅蛋白明顯增多，機(jī)體的有氧代謝能力得到改善。

伴隨著代謝方式等一系列的改變肌纖維類型也可能會(huì)發(fā)生相應(yīng)的調(diào)整。如Itoh［1］的研究表明雄性SD鼠置于模擬4 000 m低氧艙10周后，比目魚(yú)肌快縮氧化糖酵解型肌纖維（FOG）增加，慢縮氧化型纖維（SO）減少；Bigard等對(duì)Wistar鼠4 000 m高度游泳訓(xùn)練14周的研究［2］顯示，高海拔耐力練習(xí)引起快肌趾長(zhǎng)伸?。‥xtensor digitorum longus，EDL）和足底?。≒lantaris，PLA）Ⅱa型纖維增加，同時(shí)Ⅱb減少。

由于肌纖維分類方法的差異使得對(duì)于低氧及低氧耐力訓(xùn)練影響肌纖維組成的報(bào)道結(jié)果存在差異?，F(xiàn)在常用的肌纖維分類方法有肌原纖維ATP酶（肌球蛋白ATP酶）、肌球蛋白重鏈(MHC)單克隆抗體免疫組化、肌球蛋白重鏈(MHC) 聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法。

肌原纖維ATP酶（肌球蛋白ATP酶）的方法一般只能區(qū)分出Ⅱa、Ⅱb和Ⅰ三種肌纖維［3］；免疫組化方法由于缺乏特異性的Ⅱx MHC抗體，目前還不能檢測(cè)到Ⅱa與Ⅱx或Ⅱx與Ⅱb同時(shí)存在的纖維類型。肌球蛋白重鏈(MHC) 聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法可以清晰地看到四種純合的肌纖維（Ⅱa-MHC、Ⅱb-MHC、Ⅱd/x-MHC和Ⅰ-MHC），依其敏感性好、特異性強(qiáng)、可重復(fù)的特點(diǎn)廣泛用于分離MHC。

Talmadge［4］總結(jié)多人研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由MHC確定的肌纖維最大收縮速度順序?yàn)棰?lt;Ⅱa <Ⅱx <Ⅱb，除了收縮速度存在差異外，代謝特性也各不相同。因此，研究低氧及低氧耐力條件下MHC組成的改變對(duì)于了解低氧訓(xùn)練影響骨骼肌收縮特性具有重要意義。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組7周齡健康雄性Spraque Dawley(SD)大鼠30只，平均體重(210±20)g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，為國(guó)家二級(jí)衛(wèi)生動(dòng)物。飼養(yǎng)溫度控制在(22±3)℃，動(dòng)物自由進(jìn)水進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)兩天后，隨機(jī)分為三組，每組10只:

常氧對(duì)照組（Normoxic Controls,NC）

低氧對(duì)照組（Hypoxic Controls,HC）

低氧訓(xùn)練組（Hypoxic Training,HT）

1.2訓(xùn)練方式HC組和HT組動(dòng)物均生活在模擬海拔4 000 m高度的低氧艙中（氧濃度12.7％），每天至少保證22 h低氧時(shí)間。

低氧訓(xùn)練組經(jīng)5 d跑臺(tái)適應(yīng)后，進(jìn)入正式訓(xùn)練。訓(xùn)練在常氧條件下進(jìn)行，訓(xùn)練方式為跑臺(tái)練習(xí)：

跑臺(tái)坡度＋10°，跑速20 m／min，每天1次，每次1 h，每周訓(xùn)練6 d，28 d后取材。

1.3取材腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉（45 mg/kg），迅速剝離兩側(cè)淺層脛前肌，去除結(jié)締組織，錫紙包疊后置于液氮中凍存。

1.4主要測(cè)試方法和儀器

1) 骨骼肌肌球蛋白重鏈(MHC)蛋白組成：

十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳方法（SDS-PAGE）。參照Talmadge(1993)［5］

2） 骨骼肌MHCⅠ、Ⅱa、Ⅱx/d、Ⅱb四個(gè)亞型mRNA 基因表達(dá)：（RT-PCR方法 ）

低氧設(shè)備：HYPOXIC TRAINING SYSTEMS, Hypoxico Inc.(USA)

PCR引物設(shè)計(jì)：PCR引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司設(shè)計(jì)、合成。

引物序列如下表：

1.5統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，利用多因素方差一般線性模型（GLM）LSD方法檢驗(yàn)各組間是否有顯著性差異，玃<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著意義。

2結(jié)果

2.1低氧、低氧耐力訓(xùn)練對(duì)肌球蛋白重鏈(MHC)蛋白組成的影響

SDS-PAGE結(jié)果如圖1所示，依各個(gè)亞型不同的電泳遷移速率由上向下依次為Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb、Ⅰ。

由圖1和表1，慢型MHCⅠ比例不受低氧和低氧訓(xùn)練的影響；低氧、低氧訓(xùn)練均顯著降低了Ⅱa比例，其中低氧對(duì)照組下降幅度更明顯（玃<0.01）；低氧對(duì)照組（HC）、低氧訓(xùn)練組（HT）與常氧對(duì)照組（NC）比較，Ⅱx比例均明顯增加（玃<001，P<0.01）；Ⅱb的變化與Ⅱx相似，即低氧對(duì)照組和低氧訓(xùn)練組有顯著升高的Ⅱb百分比，但低氧訓(xùn)練組升高幅度顯著低于低氧安靜組。

上述結(jié)果可以總結(jié)為：?jiǎn)渭兊脱踅档土刷騛 MHC蛋白表達(dá)，取而代之的是Ⅱx和Ⅱb MHC表達(dá)升高，即低氧引起“慢型”MHC向“快型”轉(zhuǎn)化；低氧訓(xùn)練的效果與單純低氧變化趨勢(shì)一致。

2.2低氧、低氧耐力訓(xùn)練對(duì)MHCs mRNA表達(dá)的影響

3討論

3.1低氧、低氧耐力訓(xùn)練對(duì)肌球蛋白重鏈(MHC)蛋白組成的影響肌球蛋白是骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)最多的蛋白，占總蛋白的25％，由兩條重鏈和兩對(duì)不同的輕鏈組成。因其具有ATP酶活性，所以又稱肌球蛋白Ca2+-ATP酶，肌球蛋白Ca2+-ATP酶活性高低,直接決定肌纖維的收縮力量和速度。

成年骨骼肌有Ⅱa-MHC、Ⅱb-MHC、Ⅱd/x-MHC和Ⅰ-MHC四種類型，由MHC確定的肌纖維最大收縮速度順序?yàn)棰?lt;Ⅱa <Ⅱx <Ⅱb。

目前學(xué)者們對(duì)低氧的關(guān)注很多，但低氧對(duì)肌纖維和MHC組成的報(bào)道為數(shù)并不多，且研究結(jié)果也不盡相同。

如Bigard［6］將Wistar鼠置于模擬5 500 m海拔環(huán)境中4周，足底?、?、Ⅱa型MHC顯著下降，Ⅱb MHC增加；比目魚(yú)?、裥蚆HC顯著下降，Ⅱa MHC增加。肌纖維轉(zhuǎn)換方向與我們實(shí)驗(yàn)一致，一般來(lái)說(shuō)，肌纖維的轉(zhuǎn)換容易發(fā)生在快肌纖維間，Ⅰ和Ⅱ型間很難相互轉(zhuǎn)變，Bigard的實(shí)驗(yàn)足底?、裥蚆HC向Ⅱ型MHC轉(zhuǎn)換可能由于低氧刺激嚴(yán)重引發(fā)的。

多數(shù)低氧影響比目魚(yú)肌結(jié)果都是Ⅰ型MHC下降，Ⅱa增加，或者SO肌纖維下降同時(shí)FOG增加［7］。

盡管上述一些研究顯示低氧引起慢型MHC向快型轉(zhuǎn)化，但若形成缺氧不明顯MHC和肌纖維組成不會(huì)改變。

如Perhonen［8］對(duì)于Wistar鼠2 250～2 500 m高度低氧跑臺(tái)訓(xùn)練觀察氧化酶活性增加的同時(shí)，體重下降，但肌原纖維ATP酶方法檢測(cè)的肌纖維組成無(wú)明顯變化。

低氧影響肌纖維和MHC組成受低氧高度的制約。模擬低氧高度低，造成組織缺氧不足，不能引起肌纖維和MHC改變。

慢性低氧引起肌組織中的氧壓水平較低可能是引起肌纖維轉(zhuǎn)化的一個(gè)有利因素。低氧一般會(huì)使快肌纖維表達(dá)增加，這些肌纖維多數(shù)在低氧壓條件下工作，一方面是由于它們毛細(xì)血管供應(yīng)不足，另一方面它們?cè)诟邚?qiáng)度練習(xí)中易被募集。

慢性持續(xù)性低氧與運(yùn)動(dòng)引起的低氧不同，前者持續(xù)時(shí)間久，且造成缺氧程度高，這可能更適于Ⅱb等快肌纖維的表達(dá)，Ⅱb肌纖維以糖酵解為主，比氧化型纖維如Ⅰ或Ⅱa更易受局部低氧的影響。

耐力訓(xùn)練是一種增加負(fù)荷的訓(xùn)練，有研究報(bào)道負(fù)荷強(qiáng)度適宜、持續(xù)時(shí)間足夠長(zhǎng)的耐力訓(xùn)練會(huì)引起快型MHC向慢型轉(zhuǎn)化。如有研究大鼠輪跑4周比目魚(yú)?、裥蚆HC顯著增加。SD大鼠75％強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練10周的實(shí)驗(yàn)觀察到訓(xùn)練時(shí)間大于60 min時(shí)比目魚(yú)肌MHCⅠ顯著增加，同時(shí)MHCⅡa下降［9］。Wistar鼠4周耐力練習(xí)（20 m/min,60 min/d,5d／周）［10］結(jié)果顯示，足底肌MHCⅡb下降的同時(shí)MHCⅡa明顯增加。

本實(shí)驗(yàn)中低氧耐力訓(xùn)練組MHCⅡa下降幅度低于低氧對(duì)照組，與此同時(shí)MHCⅡb升高幅度同樣低于低氧對(duì)照組，這可能緣于耐力訓(xùn)練易引起快型MHC向慢型轉(zhuǎn)化。

3.2低氧、低氧耐力訓(xùn)練對(duì)MHCs mRNA表達(dá)的影響RT-PCR方法測(cè)定的各種MHC mRNA是在轉(zhuǎn)錄水平觀察MHC的變化。轉(zhuǎn)錄是蛋白合成的前提，轉(zhuǎn)錄水平的變化為蛋白水平的改變提供可能性。

低氧對(duì)MHC mRNA的影響表現(xiàn)為MHC－Ⅱa mRNA顯著增加，MHC－ⅠmRNA不顯著減少。許多關(guān)于低氧影響MHC蛋白組成的研究也表明低氧會(huì)使慢型MHC向快型轉(zhuǎn)化。低氧影響MHC蛋白的結(jié)果顯示MHC－Ⅱa向MHC－Ⅱx和MHC－Ⅱb轉(zhuǎn)化，雖然低氧影響MHC蛋白和mRNA表達(dá)改變的具體MHC不同，但均顯示快型MHC表達(dá)的增加。具體MHC不同的原因可能在于mRNA的增加能在刺激的即刻發(fā)生，其半衰期約為2～3 d，而相應(yīng)蛋白的半衰期為2～3周［11］，MHC表型的表達(dá)可能是MHCmRNA與蛋白不同時(shí)機(jī)上調(diào)和下調(diào)的結(jié)果。因而MHC表型表達(dá)與MHCmRNA間會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)配的現(xiàn)象。除此之外，翻譯或翻譯后機(jī)制的調(diào)控也妨礙mRNA準(zhǔn)確地表達(dá)蛋白活性［12-15］。

4結(jié)語(yǔ)

低氧及低氧耐力訓(xùn)練作為一種劇烈的缺氧刺激，不僅能增加骨骼肌毛細(xì)血管的分布，改善局部血液供應(yīng)，增加有氧氧化酶活性，還能引起骨骼肌微細(xì)結(jié)構(gòu)的改變，本研究顯示快型肌球蛋白重鏈表達(dá)增加，基因和蛋白表達(dá)均有表現(xiàn)。肌球蛋白是骨骼肌內(nèi)主要的結(jié)構(gòu)蛋白和收縮蛋白，其組成的改變直接會(huì)影響到肌肉的收縮速度、收縮力量及其他代謝特性。此實(shí)驗(yàn)必將會(huì)對(duì)低氧訓(xùn)練的深入研究提供一有益的啟示。

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