馬麗娟　周寶利　張淑紅　付亞文

摘要從蛇床子中提取抑制黃瓜枯萎菌的活性成分，正交優(yōu)選提取條件，并在不同濃度下測定其抑制效果。結(jié)果表明，在室溫下，95％乙醇連續(xù)超聲提取3次，每次45 min為宜；當(dāng)提取物濃度為10 mg/mL時，菌絲生長抑制率達78.65％；濃度大于100 mg/L時，孢子萌發(fā)抑制率為100％；濃度為8 mg/mL時，相對防效為40.95％。

關(guān)鍵詞黃瓜；枯萎病菌；植物提取物；蛇床子；抑菌活性

中圖分類號S 436.421

黃瓜枯萎病[Fusarium oxysporum (Schl.)f.sp.cucumerinum Owen]是設(shè)施栽培中常見的土傳病害，在我國普遍發(fā)生。一般年份發(fā)病率在20％～35％，嚴(yán)重時甚至絕產(chǎn)。傳統(tǒng)防治方法造成的“3R”(resistance，resurgence，residue)現(xiàn)象，使人們轉(zhuǎn)向研究以“環(huán)境友好的天然農(nóng)藥”來替代化學(xué)合成農(nóng)藥。利用天然植物提取物的抑菌作用來防治園藝作物真菌性病害，是近年來國內(nèi)外研究的熱點。研究表明，蛇床子提取物有一定的殺蟲抑菌作用。目前，國內(nèi)外有關(guān)蛇床子提取物的研究主要在醫(yī)學(xué)與蛇床子素抑菌方面，針對某種特定病菌的抑菌有效性研究尚少見報道。

本研究是在試驗篩選的基礎(chǔ)上，以蛇床子提取物對黃瓜枯萎菌的抑菌效果為指標(biāo)，對蛇床子的超聲波提取工藝條件設(shè)計了正交試驗。細(xì)分不同濃度提取物，對黃瓜枯萎病菌的室內(nèi)外抑制效果進行研究。本試驗通過天然植物蛇床子提取物的抑菌作用來提高黃瓜對枯萎病的抗性，對植物源農(nóng)藥的開發(fā)利用具有一定實用價值。

1材料與方法

1．1供試材料

供試黃瓜枯萎菌(F.oxysporum f.sp.cu-cumerinum)取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，按照柯赫氏法則對其進行分離鑒定。黃瓜品種為津春4號，采用基質(zhì)栽培，常規(guī)管理。蛇床子(Fructuscnidii)購自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)附屬醫(yī)院，粉碎過40目篩(孔徑0.37 mm)后備用?；瘜W(xué)試劑均為分析純。所用培養(yǎng)基為馬鈴薯(瓊脂)蔗糖PSA/PS培養(yǎng)基。試驗對照農(nóng)藥為15％多·混氨酮懸浮劑(金吉爾滅萎)購自沈陽市金點園藝有限公司。

1．2研究方法

1．2．1提取方式的篩選

為了系統(tǒng)考察蛇床子中對黃瓜枯萎病抑制活性物質(zhì)的提取工藝，根據(jù)蛇床子有效成分的性質(zhì)設(shè)計了因素與水平(表1)。

測定方法同1．2．2。

1．2．2蛇床子提取物對黃瓜枯萎菌菌絲生長的影響

采用菌絲生長速率法，測定蛇床子提取物對黃瓜枯萎菌菌絲生長的影響。將1 mL植物提取物加入到49 mL已融化并冷卻至40℃的PSA滅菌培養(yǎng)基中，混合均勻后制成平板，以純PSA培養(yǎng)基作為對照(CK₀)，藥劑500倍液為對照1(CK₁)，95％乙醇為對照2(CK₂)，每處理重復(fù)4次。在無菌條件下，接種d=0.638 cm經(jīng)純培養(yǎng)的枯萎菌菌絲圓片，24℃下暗培養(yǎng)，4 d后用十字交叉法測定菌落直徑，并計算抑菌率。

菌絲生長抑制率=1-[(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑]×100％。

1．2．3蛇床子提取物對黃瓜枯萎菌孢子萌發(fā)的影響

采用孢子懸滴培養(yǎng)法，測定蛇床子提取物對黃瓜枯萎菌孢子萌發(fā)的影響。分生孢子懸浮液的制備：在已滅菌的200 mL PS培養(yǎng)基中接入4片d=0.638 cm經(jīng)純培養(yǎng)的枯萎菌菌絲圓片，在振蕩培養(yǎng)箱中24℃振蕩培養(yǎng)14 d，過濾離心，取下層孢子溶液用無菌水稀釋，在低倍顯微鏡下一個視野約50個孢子，約為1×10⁵個/mL，放入冰箱中備用。

將不同濃度提取物分別稀釋50倍，取10μL稀釋液與10μL黃瓜枯萎菌分生孢子懸浮液于載玻片上混合(質(zhì)量濃度為10 mg/mL)，經(jīng)24℃保濕懸滴培養(yǎng)，16 h后鏡檢，記錄孢子萌發(fā)數(shù)量和總孢子數(shù)量，計算萌發(fā)率。以清水處理作為空白對照(CK₀)，藥劑500倍液為對照1(CK₁)，95％乙醇為對照2(CK₂)，每處理重復(fù)6次。

孢子萌發(fā)率=(孢子萌發(fā)數(shù)量/總孢子數(shù)量)×100％。

1．2．4蛇床子提取物對田間黃瓜枯萎病發(fā)病情況的影響

試驗于2007年3月中旬至6月初進行。經(jīng)溫湯浸種后將種子播于育苗盤。待子葉展平，且露真葉時，分苗于12 cm×12 cm育苗缽中。當(dāng)四葉一心時，對植株進行傷根接菌，每株50 mL濃度為l×10⁶個/mL的分生孢子懸浮液。接菌5 d后，分別用濃度為1、2、4、8 mg/mL的植物提取物處理幼苗，每株25 mL，共處理4次，每次間隔3天，以清水處理作為空白對照(CK₀)，澆25 mL15％多·混氨酮懸浮劑500倍液為對照1(CK₁)，最后一次處理后第3天調(diào)查發(fā)病情況，并計算病情指數(shù)及其相對防治效果。每個濃度處理10株苗，3次重復(fù)。

黃瓜枯萎病分級標(biāo)準(zhǔn)如下：

O級：全株無病；工級：發(fā)病輕微，全株有1/4以下的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；Ⅱ級：發(fā)病較重，全株有1/4～1/2的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；Ⅲ級：發(fā)病重，全株有1/2以上的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；Ⅳ級：因病枯死或接近死亡。

發(fā)病率=(發(fā)病植株數(shù)量/調(diào)查植株數(shù)量)×100％；

病情指數(shù)=[∑(病級株數(shù)×發(fā)病等級)/(調(diào)查總株數(shù)×最高等級代表值)]×100；

相對防效=[(對照病情指數(shù)一處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)]×100％。

2結(jié)果與分析

2．1正交試驗及方差分析結(jié)果

根據(jù)L₉(3⁴)正交試驗的排列組合(表2)。各取蛇床子10 g，共9份，精密稱量，隨機取樣編號為1～9號，按每個試驗號的要求進行試驗。用10 mL95％乙醇定容。提取液與蛇床子粉末的比例為5倍劑量。

由表2可以看出R_A＞R_C>R_D>R_B。由此可知，提取藥劑是影響提取率的重要因素，其次為提取次數(shù)和提取時間，影響相對較小的因素是提取溫度。再根據(jù)K值進行分析得出，A₃優(yōu)于A₁、A₂；B₁優(yōu)于B₂、B₃C₃優(yōu)于C₂、C₁；D₃優(yōu)于D₁、D₂。因此，蛇床

子抑制黃瓜枯萎菌活性成分提取工藝條件為A₃B₁C₃D₃。

將測得的蛇床子抑菌直徑進行方差分析，結(jié)果見表3。

從方差分析結(jié)果可知，A、C和D因素在統(tǒng)計學(xué)上有意義(p＜0.05)，可以選擇與這三因素相關(guān)的提取工藝。B因素?zé)o統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，選任意水平均可，但從節(jié)約能源和成本方面考慮，選1水平為好。綜上所述，從水平和測試項目分析可得最佳提取條件為A₃B₁C₃D₃，即以95％乙醇為提取溶劑，采用室溫超聲提取。提取3次，每次45 min。合并3次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀，以10 mL 95％乙醇定容，所得粗提物濃度為1 g/mL。

2．2蛇床子提取物對黃瓜枯萎菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

表4數(shù)據(jù)顯示，不同濃度植物提取物對菌絲生長抑制率均在50％以上，并隨著濃度的升高抑制能力逐漸加強。在提取物濃度為10 mg/mL時抑制率為78.65％，比藥劑對照抑制率低4.26％，濃度為20 mg/mL時抑菌能力有所減弱。當(dāng)提取物濃度為100 mg/L時，黃瓜枯萎菌孢子萌發(fā)抑制率為100％，隨著濃度的增大病菌孢子同樣不能萌發(fā)，結(jié)果同藥劑處理。95％乙醇對黃瓜枯萎菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)都存在一定的抑制作用，其對孢子抑制率為36.7％。

2．3蛇床子提取物對黃瓜枯萎病田間發(fā)病情況的影響

由表5可以看出，津春4號黃瓜品種自身對枯萎病有較強的抗性，空白對照的發(fā)病率僅為48.39％。在此基礎(chǔ)上，澆灌植物提取物，當(dāng)濃度為1 mg/mL時，發(fā)病率為40％，且隨著施用濃度的增大發(fā)病率逐漸減小。當(dāng)濃度為8 mg/mL時，發(fā)病率為26.67％，與藥劑對照相差約6％，病情指數(shù)相差近10％。相對防治效果也隨著提取物濃度的加大而升高。當(dāng)濃度為1 mg/mL時，相對防效僅為8.15％，但當(dāng)濃度為8 mg/mL時，相對防效達40.95％。

3討論

蛇床子為傘形科蛇床屬植物蛇床[Cnidiummonnieri(L.)Cusson]的干燥成熟果實，主要含有揮發(fā)油及蛇床子素等香豆素類成分。傳統(tǒng)提取方法采用水煎煮、醇提或石油醚提取，提取能力差，有效成分損失嚴(yán)重，雜質(zhì)多。超聲提取原理主要是利用超聲的空化作用對細(xì)胞膜的破壞，有助于有效成分的溶出和釋放，且其具有提取速度快、時間短、收率高、無需加熱等特點。試驗表明，提取溶劑對天然植物有效成分的提取有著重要作用。且在提取溶劑總量不變的情況下，多次提取更有利于活性成分的滲出，但與提取時間長短關(guān)系不顯著。本工藝有利于蛇床子抑制黃瓜枯萎菌有效成分的提取，且操作簡便易行，適合于今后近一步研究并應(yīng)用于園藝作物生產(chǎn)。

黃瓜枯萎病是設(shè)施黃瓜生產(chǎn)上的重要病害，近年來由于設(shè)施栽培面積的不斷擴大，其發(fā)病趨勢也隨之加大。本試驗以蛇床子提取物抑制黃瓜枯萎病菌，在所設(shè)濃度內(nèi)對菌絲生長抑制率均在50％以上，當(dāng)濃度為10 mg/mL時抑制率為78.65％，高于其他濃度。這說明抑制有效濃度在此范圍內(nèi)，提高濃度則效果不顯著。在濃度為100 mg/L時，對孢子萌發(fā)有顯著的抑制作用，表現(xiàn)為孢子畸形生長。95％乙醇對照亦能在一定程度上抑制黃瓜枯萎菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)，但對比植物提取物和藥劑仍有明顯的差距。藥劑對照與所設(shè)濃度最高抑制率相差4％，說明生物抑菌有很大的研究價值和發(fā)展空間。

結(jié)合抗病品種津春4號的遺傳優(yōu)勢，以天然植物蛇床子提取物灌根處理幼苗，當(dāng)濃度為1 mg/mL時，相對防效僅為8.15％。但隨著澆灌濃度的增大，相對防效以10％以上的梯度遞增，當(dāng)濃度為4 mg/mL時增長稍緩，濃度為8 mg/mL時相對防效達到40.95％，且有一定的增長空間。關(guān)于田間施用的最佳提取物濃度還有待進一步深入研究。