張明旭　徐敬堯　歐澤深

（1. 安徽理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，安徽 淮南 232001；2. 中國礦業(yè)大學(xué)化工學(xué)院 ， 江蘇 徐州 221008）

摘 要： 幾種不同真菌S1、S4 、S7及其混合菌對硝酸預(yù)處理義馬褐煤的降解轉(zhuǎn)化研究表明 ：幾種真菌對其都有一定的降解轉(zhuǎn)化作用，混合菌對煤的轉(zhuǎn)化率最高達(dá)34.8％，S7 、S1菌 次之，S4菌最弱達(dá)25.4％。同時進(jìn)行了幾種不同真菌對不同煤種的轉(zhuǎn)化效果對比研究。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明，煤種對煤微生物降解作用影響很大，低階煤比高階煤更易被微生物作用與攻擊。 對煤炭微生物降解轉(zhuǎn)化機(jī)理進(jìn)行了探討，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合煤炭的生成規(guī)律。

關(guān)鍵詞：真菌；褐煤；生物降解

Study on Coals Transformation in the Way of

Solid Dissolution by Some Epiphytes

ZHANG Ming-xu1,XU Jing-yao1,OU Ze-shen2

(1. School of Materials Science and Engineering,

Anhui University of Science &

T echnology, Huainan, Anhui 232001, China;2. School of Chemical Engineering a nd Technology, China University of Mining and Technology, Xuzhou Jiangsu 221008,

China)

Abstract: Nitric acid pretreated Yima lignite biodegradation by several differen t epiphytes S1, S4, S7 and their mixture were studied. The results showed that t he epiphytes have certain effect of degradation and transformation of coal. Tran sformation ratio by mixed bacteria is up to 34.8 percent, by bacteria S7 or S1 f ollowed, and by bacteria S4 only to 25.4 percent. Transformation effect of diffe rent coals by different epiphytes was studied for comparison. The experiment res ults showed that coal rank has great effect on coal biodegradation, low-rank coa l is attacked more easily by microorganisms than high-rank coal. The mechanism o f coal biodegradation was discussed, and the experiment results accord with coal 's generation regularity.

Key words:epiphyte; lignite; biodegradation

我國褐煤資源儲量豐富， 由于其水分和灰分含量高、 熱穩(wěn)定性差、 發(fā)熱量低， 這使褐煤 的利用 受限， 并造成浪費(fèi)和環(huán)境污染［1］。因此，尋找經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的途徑加工處理褐煤， 使褐煤成為清潔的燃料、化工原料和有特殊價值的化學(xué)品是亟待解決的問題［2-3］ 。

煤的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)主要是利用微生物實(shí)現(xiàn)煤的溶解、液化或氣化，從而使煤發(fā)生降解［ 4］。因生物催化的條件溫和、催化劑高度專一，微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)成為近年來研究的熱點(diǎn) 。褐煤的微生物降解研究始于20世紀(jì)80年代。德國Fakoussa［5］和美國Cohen［ 6］發(fā)現(xiàn)，某些真菌能在煤塊上生長，并能將煤轉(zhuǎn)化為黑色液體。此后，煤的生物轉(zhuǎn)化研 究在世界上引起注意并取得了一定的研究進(jìn)展［7-8］。國內(nèi)外研究者已分離出若干 微生物，這些微生物（包括細(xì)菌、放線菌、真菌）可降解經(jīng)氧化處理后的低價煤（氧化狀態(tài) ），但其降解能力有限［9］。隨著全球石油資源緊缺狀況的加劇，篩選了煤炭 降解轉(zhuǎn)化新菌種，對實(shí)現(xiàn)煤炭的微生物降解具有深遠(yuǎn)意義。

在溶煤方式上國內(nèi)外研究者主要集中在固體溶煤和液體溶煤兩種方式上［10］，一 般 來說，固體溶煤比液體溶煤效果要好，液體溶煤主要是為了進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用，而進(jìn)行研 究的。液體溶煤又可分為菌體液體培養(yǎng)溶煤和菌體培養(yǎng)液（不含菌體）溶煤，它們主要是用 來對溶煤機(jī)理進(jìn)行研究，考察是哪種因素使得煤發(fā)生溶解降解作用等。為進(jìn)一步了解真菌對 中國褐煤和其它煤的生物降解轉(zhuǎn)化的基本特性，本研究采用了幾種真菌對幾種不同煤種和性 質(zhì)的有代表性煤進(jìn)行了更加直觀的固體溶煤轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 煤樣ナ匝橛妹貉有三種，第一種為河南義馬褐煤，堆放時間二年以上；第二種為內(nèi)蒙平煤集團(tuán)西 露天礦褐煤，堆放時間二年；第三種為淮南次煙煤。原煤樣經(jīng)破碎磨礦，進(jìn)行化驗(yàn)分析。

褐煤含有大量腐植酸和較多水分、灰分。一些金屬離子與褐煤中的酸性官能團(tuán)結(jié)合并使其處 于非游離狀態(tài)，影響煤樣微生物轉(zhuǎn)化率。通過酸洗或浸泡可溶解與官能團(tuán)結(jié)合的金屬離子， 釋放游離羧基并減少結(jié)構(gòu)單元間的交聯(lián)鍵，從而有利于褐煤的微生物降解。此外，酸洗也是 褐煤脫硫、脫灰的方法之一。將新采義馬褐煤粉碎至所需粒級，使用濃度為5 m ol/L的硝酸溶液浸泡煤樣2 d后，用2XZ-2型旋片式真空泵過濾煤樣并用蒸餾水 清洗，直至濾液pH值接近7，將煤樣烘干、消毒。幾種煤樣的工業(yè)分析及硫含量數(shù)值見表1。

0.111.2 菌種與培養(yǎng)基

1.2.1 S1菌株—白腐真菌 白腐菌（white rot Fungus）, 是對具有降解木素能力的一類真菌的總稱，因分解木材后留 下的殘留物為白色而得名。其在生物學(xué)上分類屬于擔(dān)子類（Dsidiornvcetes），腐生于樹木 或木材上，使木材上出現(xiàn)袋狀、片狀或有環(huán)痕狀等形狀的淡色海綿狀團(tuán)塊，菌絲體（myceli um）為有隔膜多核態(tài)（達(dá)15個），它通常以無性生殖方式構(gòu)成其生活史。在環(huán)境誘導(dǎo)下可形 成擔(dān)孢子(Basidum)，其有性結(jié)合方式為同宗配合，所形成擔(dān)孢子是核質(zhì)相同的雙核體。白 腐菌可在木質(zhì)素細(xì)胞腔內(nèi)產(chǎn)生大量細(xì)胞外過氧化物酶（extracelluler peroxidose enzyme ）,有很強(qiáng)的降解木質(zhì)素大分子的能力。最適生長溫度：28～38 ℃，可根據(jù)白 腐菌的特征反應(yīng)即Bavendamm反應(yīng)來進(jìn)行鑒定。

試驗(yàn)中所用菌種為實(shí)驗(yàn)室從腐爛樹木和長期堆積的腐爛雜物下面進(jìn)行分離純化培養(yǎng)而得。

1.2.2 S4菌株—綠色木霉 綠色木霉(Trichoderma Viride pers.exFr.)，主要分解降解木材中纖維素和部分的木質(zhì)素 ，腐生于木質(zhì)和纖維類物質(zhì)上，使其腐朽，產(chǎn)生綠色霉?fàn)钗?，其適應(yīng)性強(qiáng)，廣泛存在于自然 界的各種有機(jī)物質(zhì)中，常以分生孢子的形式漂浮在空氣中，最適生長溫度：28～38 ℃，營養(yǎng)要求不高；在營養(yǎng)豐富的基質(zhì)上生長非常迅速，菌落很快長滿整個培養(yǎng)皿，菌 落呈綠色絨狀。培養(yǎng)生長過程中產(chǎn)生纖維素酶，而分解纖維素。

試驗(yàn)中所用S4菌為實(shí)驗(yàn)室從腐爛樹木和堆積的腐爛雜物下面進(jìn)行分離純化培養(yǎng)而得。

1.2.3 S7菌株—褐腐菌 褐腐菌（brown rot Fungus）是使木材呈褐色腐朽類真菌，其降解木質(zhì)素能力弱于降解纖維 素能力。其大部分屬于擔(dān)子菌，主要降解木材中的多糖，不能完全降解木質(zhì)素，且留下褐色 殘留物。褐腐菌絲一般聚集在木材細(xì)胞腔內(nèi)，從已有孔口或細(xì)胞壁上鉆洞進(jìn)入鄰近 細(xì)胞， 因 分解過程中， 褐腐菌先從次生細(xì)胞壁物質(zhì)開始降解，初生細(xì)胞壁中間層特別抗褐腐菌分解 ， 因其木質(zhì)素含量高。褐腐菌分解時，木質(zhì)素中的甲氧基明顯地減小，進(jìn)一步分解時大部分多 糖被消耗，細(xì)胞壁塌陷，造成木材體積減少。最適生長溫度：28～38 ℃ ，其生長相對較慢，菌絲短。

試驗(yàn)中所用S7菌為實(shí)驗(yàn)室從腐爛樹木和堆積的腐爛雜物下面進(jìn)行分離純化培養(yǎng)而得。

1.2.4 混合菌 混合菌為以上三種菌的混合菌。

制備方法是：分別提取真菌S1，S4，S7的孢子，分別稀釋至106個/mL，混合后培養(yǎng)所得。

1.2.5 培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯浸出液， 20 g葡萄糖， 3

7H2O，0.2 mg CuSO 4?5H2O，8 mg維生素B1。

1.2.6 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)條件：pH=7.2；溫度28 ℃；靜止恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 煤炭微生物降解率的計算ヅ嘌7 d后，用去離子水沖洗培養(yǎng)皿，把剩余煤殘渣沖下，小心挑出菌絲體，過 濾干燥，稱重。計算轉(zhuǎn)化率

η＝（M0－M）/M0×100%

式中：η為降解轉(zhuǎn)化率(失重率)，%；玀0、M分別為轉(zhuǎn)化試驗(yàn)前后所加煤樣和 煤殘渣重量，g。

1.4 試驗(yàn)方法ピ諶舾篩齬燙迮嘌基上分別劃線接種純化的各菌種，28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，待菌 絲長滿培養(yǎng)皿，均勻薄薄地加入一層硝酸預(yù)處理義馬褐煤樣0.1 g（＜0.2 mm，已消毒）。同時在空白未接種菌種的培養(yǎng)皿上也均勻?yàn)⑸弦槐用簶?，作為?白對照試驗(yàn)，28 ℃恒溫培養(yǎng)若干天，測其煤炭降解轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾種真菌對硝酸預(yù)處理義馬褐煤的降解轉(zhuǎn)化ヅ嘌過程中轉(zhuǎn)化現(xiàn)象觀察： 加過煤樣后， 在28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)4 d， 仔細(xì)觀察培養(yǎng)皿上煤樣， 發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)皿上煤樣有軟化、 脫色、 顏色變淺、 被菌絲 覆蓋、 淹沒的現(xiàn)象， 尤其接種S4、 S7和混合菌的培養(yǎng)皿中菌落長勢良好， 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基本身 也有軟化現(xiàn)象， 且處于似流動狀態(tài)， 溶解轉(zhuǎn)化煤炭效果明顯。

28 ℃培養(yǎng)6 d后，仔細(xì)觀察菌體及煤粒，可以發(fā)現(xiàn)，菌體沿著煤粒 周圍生長，且使煤粒出現(xiàn)明顯的黑色液珠或培養(yǎng)基被染成棕黃色至黑色。有些平板在第6 d(部分第8 d或更長時間)出現(xiàn)被液化的黑色液滴，并且煤粉分布稀疏 的地方液珠較多，而煤粉堆積的地方?jīng)]有觀察到液珠，生成的液珠由于滲入培養(yǎng)基中而消失 掉，培養(yǎng)基進(jìn)而被染成黑色。幾種真菌對硝酸預(yù)處理義馬褐煤的降解轉(zhuǎn)化率如表2所示（培 養(yǎng)時間為7 d）。

表2 固體培養(yǎng)轉(zhuǎn)化率計算

接種菌種空白S1S4S7混合菌轉(zhuǎn)化率/%10.328.425.430.534.82.2 不同菌種對不同煤種的轉(zhuǎn)化效果對比ピ詼啻問笛櫓校發(fā)現(xiàn)不同的菌種在煤降解過程中出現(xiàn)油狀液珠的情況不一樣，時間有長有短 ，S4菌甚至就不能出現(xiàn)液狀物，混合菌與S7出現(xiàn)油狀液珠的時間較短，但S7菌的降解率較低 ，故試驗(yàn)考察對比了不同菌種對不同煤種的固體降解轉(zhuǎn)化能力和效果，其方式是直觀的通過 降解轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中煤樣有無出現(xiàn)油狀液珠和出現(xiàn)油狀液珠時間的長短來反映不同菌種對不同煤 種的固體降解轉(zhuǎn)化能力和效果，詳細(xì)結(jié)果如表3所示。在表3中，中間數(shù)據(jù)表示出現(xiàn)油狀液珠 的天數(shù)，“無”表示不能出現(xiàn)油狀液珠。從表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中我們發(fā)現(xiàn)，褐煤易在降解中出現(xiàn) 油狀液珠，而次煙煤幾乎不能出現(xiàn)油狀液珠。在褐煤中，義馬褐煤相對內(nèi)蒙褐煤來說更易產(chǎn) 生油狀液珠。混合菌種和S1 較好，而S4菌則對幾種煤都不能產(chǎn)生油狀液珠。培養(yǎng)過程中， 混合菌在整個培養(yǎng)基上生長，甚至把煤樣覆蓋，而S7菌則是圍繞煤粒周圍生長，吸收煤中碳 源，使煤塊軟化、脫色、進(jìn)而轉(zhuǎn)化為液珠。

微生物對 煤的轉(zhuǎn)化表現(xiàn)在溶解和降解兩個方面，溶解是降解的前提。溶解只是一種物理作用，但組成 成分并沒有改變；降解則是生物化學(xué)作用及酶等其它類因素作用，物質(zhì)的濃度和組成成分都 會發(fā)生變化。液珠的產(chǎn)生和培養(yǎng)基變色是煤被微生物溶解的明顯現(xiàn)象，前者可能是由于溶解 產(chǎn)物中含有生物表面活性物質(zhì)，它們包裹在液體產(chǎn)物的外面，形成具有疏水層的液珠，而后 者則不含表面活性物質(zhì)，因此滲入培養(yǎng)基使培養(yǎng)基染色。煤降解的直觀表象為質(zhì)量損失，其 次是分子量及基團(tuán)發(fā)生變化。

真菌對煤炭的降解轉(zhuǎn)化過程實(shí)質(zhì)上是一個既包括氧化又包括氫化的降解過程，包含對有機(jī)物 和高分子有機(jī)聚合體的降解兩部分。

真菌對褐煤及其硝酸處理褐煤中有機(jī)物的降解機(jī)理是以自由基為基礎(chǔ)的鏈反應(yīng)過程，是一個 深度氧化降解及結(jié)構(gòu)破壞和重新組合過程，相比硝酸處理后的樣品，在煤微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中 N含量有相當(dāng)程度的下降，H含量有很大程度的提高，說明煤的生物降解過程中，微生物吸收 其中的氮作為氮源，發(fā)生氫化水解過程，煤中高聚物的價鍵被打斷，氫原子替補(bǔ)上去，使得 煤轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物中H含量增加。在煤降解后的殘渣中S含量有一定程度的下降，說明真菌對硫有 一定的脫除作用。

其對高分子有機(jī)聚合物的降解是木質(zhì)素酶作用的結(jié)果：真菌分泌到胞外的木質(zhì)素降解酶包括 木素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶等，這些菌胞外酶對含有類木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的低價煤具有 很強(qiáng)的降解轉(zhuǎn)化作用，能對類木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的大分子芳香結(jié)構(gòu)基團(tuán)進(jìn)行攻擊，使低價煤芳香結(jié) 構(gòu)中大分子物質(zhì)的支鏈、側(cè)鏈斷裂，變成較小的小分子物質(zhì)而溶解。

4 結(jié)論

(1） 幾種真菌對義馬褐煤都有一定的降解轉(zhuǎn)化作用，固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后 ，混合菌種作用的效果較好，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到34.8%，其次是S7菌株，S4菌株降解率較低。

(2） 添加煤樣后真菌的生長情況顯示混合菌與S1菌雖生長旺盛，但降解轉(zhuǎn)化率不同；說明 混合菌在生長過程中，釋放出不同的酶，它們共同作用煤中大分子物質(zhì)，體現(xiàn)出微生物的協(xié) 同共生、互生的生物作用，提高降解率。

(3） 煤種對煤微生物降解作用影響很大，實(shí)驗(yàn)表明低階煤比高階煤更易被微生物作用與攻 擊；義馬褐煤比內(nèi)蒙褐煤更易發(fā)生降解作用，這可能是義馬褐煤的氧化風(fēng)化程度比內(nèi)蒙褐煤 高，義馬褐煤具有更高的O/C比，有更多的孔隙結(jié)構(gòu)，使溶煤活性物更容易透入和攻擊從而 發(fā)生降解。

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(責(zé)任編輯：李 麗)