劉文洪　洪　健　陳集雙　葉美琴　黃東峰

摘要應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)了浙江麗水和杭州的東方百合、亞洲百合等栽培品種上黃瓜花葉病毒(CMV)，64個(gè)田間樣品中有26個(gè)帶毒，檢出率為40．6％~dsRNA檢測(cè)結(jié)果與已知CMV—FQS株系的電泳條帶相同，但百合組織中CMVdsRNA含量較低；電鏡觀察，受CMV侵染的樣品中大多含有線狀病毒，復(fù)合侵染率為35．9％；寄主反應(yīng)測(cè)定顯示從百合植株上獲得的CMV株系均不能通過(guò)汁液摩擦接種侵染昆諾藜、莧色蔡、普通煙、心葉煙等6科10種指示植物。

關(guān)鍵詞植物病理學(xué)；黃瓜花葉病毒；百合；EIJSA；dsRNA檢測(cè)

中圖分類號(hào)S 436．8

百合是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，鱗莖宜糧宜菜，還可入藥，花供觀賞，在我國(guó)各地已有規(guī)?；N植，但病毒病已成為嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素。研究侵染百合的病毒種類及診斷檢測(cè)技術(shù)，對(duì)控制百合病毒的發(fā)生危害具有重要意義。目前國(guó)外報(bào)道百合病毒病原有14種之多，但主要危害的有黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaic uirus，CMV)、百合無(wú)癥病毒(Lis2anptomless virus，LSV)、百合斑駁病毒(lily mottle virus,LMoV)、百合叢簇病等4種。在我國(guó)，尚未見(jiàn)有關(guān)侵染百合的CMV研究報(bào)道。本文經(jīng)過(guò)一年多調(diào)查，發(fā)現(xiàn)浙江麗水和杭州的東方百合、亞洲百合等栽培品種普遍受到病毒侵染，由于百合種球來(lái)源不同，帶毒情況復(fù)雜，田間發(fā)病癥狀呈多樣化，復(fù)合侵染現(xiàn)象十分普遍。通過(guò)常規(guī)生物接種進(jìn)行寄主反應(yīng)測(cè)定，結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附(EIJSA)技術(shù)、&RNA檢測(cè)技術(shù)、電鏡負(fù)染色觀察等，對(duì)侵染兩地百合的CMV進(jìn)行了檢測(cè)診斷，并初步分析了田間樣品的復(fù)合感染情況，為進(jìn)一步應(yīng)用分子生物學(xué)手段進(jìn)行百合病毒種類的分子鑒定奠定了基礎(chǔ)。

1材料和方法

1．1病毒材料的采集與保存

自然發(fā)病或無(wú)明顯癥狀的東方百合[LiliumCVS．(Oriental Hybrids)]、亞洲百合[LiliumCVS．(AsiaticHybrids)]、百合鐵亞雜種[Lilium cvs(L/A)]等各品種材料于2002年4一12月分別采自浙江省麗水市百合種植基地和杭州市郊等地，按照采集時(shí)間、百合品種等內(nèi)容進(jìn)行田間記錄和編號(hào)，1～45號(hào)為東方百合，46～57號(hào)為亞洲百合，58—63號(hào)為百合鐵亞雜種，64號(hào)甜百合為食用百合。部分樣品將整株病株從田間移植到溫室進(jìn)行觀察研究。

1．2ELlSA檢測(cè)

參照馬德芳的方法用抗體夾心ELISA法檢測(cè)田間百合樣品是否被黃瓜花葉病毒(CMV)侵染，CMV酶標(biāo)抗體購(gòu)自北京雙贏世元生物技術(shù)公司。

1．3dsRNA檢測(cè)

對(duì)經(jīng)過(guò)CMV抗體ELISA檢測(cè)呈陽(yáng)性的一個(gè)東方百合樣品(2號(hào))提取dsRNA，進(jìn)行l(wèi)％瓊脂糖凝膠電泳，以接種侵染番茄的CMV分離物FQS的心葉煙作為對(duì)照。

1．4感病組織汁液中線狀病毒電鏡檢測(cè)

將經(jīng)過(guò)ELISA檢測(cè)的田間百合葉片組織在研缽中充分研磨至勻漿，用銅網(wǎng)蘸取組織粗汁液，直接用2％磷鎢酸(PTA)負(fù)染色，在JEM—1200EX型透射電鏡下觀察線狀病毒粒子的有無(wú)。

1．5寄主反應(yīng)測(cè)定

取經(jīng)過(guò)ELISA和dsRNA檢測(cè)證實(shí)被CMV侵染的東方百合樣品(2號(hào))作為毒源，用常規(guī)汁液摩擦法接種于茄科(Solanaceae)、葫蘆科(Cucuribita—ceae)、藜科(Chenopodiaceae)、莧科(Amaranthace—ae)、十字花科(Cruciferae)、豆科(1．eguminosae)等6科10種供試植物，以CMV-FQS株系作為對(duì)照同時(shí)接種上述10種植物，第l批接種試驗(yàn)重復(fù)3次，第2批接種試驗(yàn)重復(fù)2次，觀察并記錄癥狀發(fā)生情況，不能顯示癥狀的植物用枯斑寄主檢測(cè)其隱癥帶毒情況。

2結(jié)果

2．1百合病毒病的田間癥狀

受病毒侵染的百合田間癥狀多樣，主要體現(xiàn)在葉、花、莖上(封面彩圖，田間主要癥狀有斑駁、條斑、花葉、黃化壞死、花碎色、畸形、黃扁叢簇。)病害最為嚴(yán)重的是東方百合各品種。

2．2CMV抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果

對(duì)64個(gè)田間樣品用CMV抗體進(jìn)行E1．ISA檢測(cè)，結(jié)果顯示：64個(gè)樣品中有26個(gè)樣品呈陽(yáng)性，CMV的檢出率為40．6％(表1)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，來(lái)自百合上CMV的ELISA陽(yáng)性反應(yīng)較其他來(lái)源的CMV弱，OD值顯示相對(duì)較低，表明百合CMV與其他來(lái)源的CMV在血清學(xué)上有一定的差異。

2．3dsRNA檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)E1．ISA檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)的2號(hào)樣品提取dsRNA，l％瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示有大小為3 300nt、3 000nt、2 200nt左右的3條電泳條帶，與作為對(duì)照的已知CMV(FQS)感染心葉煙上得到的ds RNA條帶相同(圖1)，表明2號(hào)百合樣品中含有CMV，這與ELISA檢測(cè)結(jié)果一致。

2．4百合樣品線狀病毒電鏡檢測(cè)結(jié)果

對(duì)64個(gè)田間百合樣品進(jìn)行電鏡負(fù)染色觀察發(fā)現(xiàn)有48個(gè)樣品存在著線狀病毒粒子，其中有23個(gè)樣品同時(shí)檢測(cè)到CMV(表1)，表明為線狀病毒與CMV復(fù)合侵染，復(fù)合侵染率達(dá)35．9％。

2．5寄主反應(yīng)測(cè)定結(jié)果

寄主接種試驗(yàn)結(jié)果顯示，從百合病株上獲得的CMV不能通過(guò)汁液摩擦接種侵染昆諾藜、莧色藜、普通煙、心葉煙等指示植物，而作為對(duì)照毒株CMV(FQ5)則在這些指示植物上表現(xiàn)出典型的侵染癥狀(表2)，這表明侵染百合的CMV可能對(duì)百合植物產(chǎn)生了寄主適應(yīng)性變異，喪失了通過(guò)汁液摩擦接種傳播的特性。同時(shí)也表明復(fù)合侵染的線狀病毒也不能通過(guò)汁液摩擦侵染這些指示植物。

3討論

通過(guò)對(duì)浙江麗水、杭州兩地田間百合各栽培品種EIASA檢測(cè)，查明CMV在東方百合、亞洲百合、百合鐵亞雜種及甜百合上普遍發(fā)生，感病率達(dá)40．6％。電鏡觀察，田間CMV感染的樣品大多含有線狀病毒，CMV與線狀病毒的復(fù)合侵染率為35．9％，具有病毒多樣性的特點(diǎn)。田間百合發(fā)病情況復(fù)雜，癥狀表現(xiàn)不規(guī)律，往往是多種癥狀復(fù)合表現(xiàn)。此外，發(fā)病癥狀還與溫度有關(guān)，溫度過(guò)低(<5℃)或過(guò)高(>30℃)時(shí)，癥狀表現(xiàn)不明顯。寄主反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，從百合上獲得的CMV分離物不能通過(guò)汁液摩擦接種侵染昆諾藜、莧色藜、普通煙、心葉煙等常規(guī)CMV指示植物，可能是CMV長(zhǎng)期侵染百合，發(fā)生了對(duì)自‘合植物的寄主適應(yīng)性變異，完全喪失了通過(guò)汁液摩擦傳播的特性。此外，在表現(xiàn)黃扁癥狀的百合植株中未檢測(cè)到線狀病毒和CMV，可能是其他病因所致。

CMV作為侵染百合的主要病毒之一，在世界上已有不少報(bào)道。Benetti等報(bào)道CMV在意大利百合上廣泛發(fā)生，并且常與LSV復(fù)合侵染。Kim等用組織吸附免疫的方法檢測(cè)侵染百合的CMV，并指出來(lái)自百合的分離物不能使茄科和葫蘆科等易被CMV侵染的作物發(fā)病，是相對(duì)獨(dú)立的一個(gè)類群。Cohen等報(bào)道CMV是以色列百合主要病毒之一。Korbin等研究了波蘭觀賞植物上的CMV分離物特性，發(fā)現(xiàn)百合等植物上分離的CMV不能通過(guò)汁液摩擦使CMV系統(tǒng)與鑒別寄主發(fā)病，喪失了通過(guò)汁液摩擦接種傳播的特性。Masuta等報(bào)道了日本和韓國(guó)侵染百合的兩個(gè)CMV分離物，其寄主范圍僅限于百合，不能通過(guò)汁液摩擦接種傳播。本試驗(yàn)結(jié)果與之吻合。

侵染百合的病毒寄主范圍往往都比較窄。根據(jù)本研究結(jié)果，CMV在百合上已形成了株系分化，或在長(zhǎng)期無(wú)性繁殖過(guò)程中喪失了通過(guò)汁液摩擦傳播的能力，因而很難像侵染其他植物的CMV株系那樣通過(guò)生物接種進(jìn)行分離、鑒定與檢測(cè)。在進(jìn)行百合脫毒處理和病毒研究過(guò)程中需要結(jié)合分子雜交等其他分析手段進(jìn)行診斷檢測(cè)。因此，通過(guò)分子生物學(xué)方法對(duì)侵染百合的CMV以及其他病毒進(jìn)行基因組序列研究，不僅可以確定其進(jìn)化親緣關(guān)系及產(chǎn)生寄主適應(yīng)性變異的分子基礎(chǔ)，同時(shí)也將為生產(chǎn)健康優(yōu)質(zhì)的百合提供條件。