孟慶剛　孔慶愛(ài)等

孟慶剛孔慶愛(ài)唐強(qiáng)高兵兵張寧指導(dǎo):于致順

(大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院,遼寧116622;大連市中醫(yī)醫(yī)院;黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院)

摘要選擇107例急性腦梗塞患者,根據(jù)發(fā)病時(shí)間順序按隨機(jī)表將其分為8組。采用D-二聚體為指標(biāo),進(jìn)行治療前后連續(xù)性檢測(cè)。結(jié)果:早期針刺組中D-二聚體的改善程度均優(yōu)于其它各組(P<0.05),表明頭穴透刺有助于溶栓,尤其是早期溶栓(12 h以?xún)?nèi))。針刺在尿激酶對(duì)血栓的溶解過(guò)程中起到很重要的作用,從某種意義上講,針刺拓寬了"治療時(shí)窗",從而為挽救"缺血性半暗帶"創(chuàng)造了有利條件。

主題詞腦梗塞/針灸療法血栓溶栓療法D-二聚體

針刺治療急性腦梗塞療效確鑿。近年來(lái),臨床發(fā)現(xiàn)針刺對(duì)溶栓治療急性腦梗塞有積極的促進(jìn)作用。以往的研究資料表明:D-二聚體檢測(cè)是一項(xiàng)鑒別原發(fā)性纖溶和繼發(fā)性纖溶以及監(jiān)測(cè)溶栓治療的有價(jià)值的指標(biāo)。因此,筆者利用自制單克隆抗體,建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)雙抗體夾心法檢測(cè)血漿D-二聚體含量,觀(guān)測(cè)針刺對(duì)溶栓患者D-二聚體的影響,以進(jìn)一步證實(shí)針刺在促進(jìn)纖溶過(guò)程中的作用。

1一般資料

1.1研究對(duì)象

觀(guān)察組A自1996年5月～1997年10月選取了107例發(fā)病在24 h以?xún)?nèi)的經(jīng)CT證實(shí)確診為急性腦梗塞(頸內(nèi)動(dòng)脈系)住院患者,男67例,女40例;年齡35～75歲,平均53.6歲。按入院先后順序分為發(fā)病12 h以?xún)?nèi)組B1(含12 h)、和大于12 h組B2(含24 h)。然后再將12 h以?xún)?nèi)組病人隨機(jī)分為早期針刺溶栓組(A1B1)13例,早期溶栓組(A2B1)11例,早期常規(guī)治療組(A3B1)13例,早期針刺常規(guī)治療組(A4B1)12例;同理,將大于12 h B2組病人隨機(jī)分為針刺溶栓組(A1B2)16例,溶栓組(A2B2)14例,常規(guī)治療組(A3B2)13例,針刺常規(guī)治療組(A4B2)15例。擬以溶栓組(A2)、常規(guī)治療組(A3)、針刺常規(guī)治療組(A4)為針刺溶栓組(A1)的對(duì)照組。以上各組病人,均由神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師根據(jù)臨床評(píng)分、CT、病理和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果診斷,符合有關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)照組C正常組C1(40例),健康中青年男女各半;年齡20～50歲,平均43歲。均為醫(yī)院健康獻(xiàn)血員。老年人組C2(20例),健康老年人男12例,女8例;年齡51～75歲,平均57.7歲。均經(jīng)體檢排除高血壓、冠心病、高血脂、糖尿病,無(wú)煙、酒嗜好,近2周內(nèi)無(wú)服藥史。

1.2觀(guān)測(cè)指標(biāo)D-二聚體單抗的制備

純化抗原:在200 mg純纖維蛋白原(Fg)中,分別加入5 mmol/L的CaCl2,50 U的純凝血酶,4 mg的因子X(jué)Ⅱ,0.15 mol/L的NaCl,0.1 mol/L Tris,使pH=7.4于37 ℃溫育18 h后,再分別加入1.2 mg純纖溶酶,500 U的尿激酶,靜置18 h后,用0.01 mol/L的Tris緩沖液透析,pH=8.6。然后用DEAE-52層析,SDS電泳分析,將D-二聚體部分合并。用PEG透析濃縮后再次分離,得到純度較高的D-二聚體作為抗原。

單抗制備:選用8周齡雄性BALB/C小鼠,用福氏完全佐劑加20 μg D-二聚體純抗原,常規(guī)腹腔注射,免疫2次,間隔4、8周,再用20 μg D-二聚體抗原加強(qiáng)免疫,4天后殺死小鼠,取脾做細(xì)胞融合,2周后待細(xì)胞克隆長(zhǎng)到約為培養(yǎng)孔的1/8時(shí),用抗原進(jìn)行篩選,得到8個(gè)特異性D-二聚體單抗株。

1.3研究方法

(1)ELISA法的建立

采用雙抗體夾心法。用1株自制D-二聚體單抗,包被于聚丙乙烯塑料板,另1株單抗標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶,經(jīng)交叉配對(duì)試驗(yàn),找到2株能夠用于D-二聚體的捕捉法測(cè)定,此即ELISA雙抗體夾心法。

(2)D-二聚體檢測(cè)方法

血漿準(zhǔn)備:取患者靜脈血,用0.13 mol/L檬酸鈉1∶9抗凝,3000 r/min,低溫離心,分離血漿,于-20 ℃下保存待檢。

檢測(cè)方法:在包被單抗的酶標(biāo)反應(yīng)板上,加入待檢樣品和不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品,37 ℃溫育1 h后,洗4次,再加入酶標(biāo)記的單抗,37 ℃溫育30 min后,洗4次,再加OPD底物顯色,37 ℃溫育15 min,加2 mol/L硫酸中止反應(yīng)。最后在492 nm波長(zhǎng)下比色,根據(jù)曲線(xiàn)求得D-二聚體含量,單位是mg/L血漿。

(3)治療方法

針刺溶栓組A1:包含B1、B2兩組,入院后即針刺同時(shí)檢測(cè)指標(biāo),然后再靜脈溶栓。

溶栓方法:采用南京大學(xué)制藥廠(chǎng)生產(chǎn)的尿激酶50～75萬(wàn)U,加入0.85% NaCl 250 ml,每日1次靜滴,1～1.5 h滴完,連用3天。用藥前常規(guī)檢查出凝血時(shí)間、血小板,沒(méi)有出血傾向時(shí)可用。同時(shí)口服維生素C 300 mg,維生素E 100 mg,每日3次;用藥第2天給腸溶阿斯匹林40 mg,每日1次口服。3天后用精制蝮蛇抗栓酶2.0 U加入0.85%NaCl 250 ml每日1次,靜滴1周,然后改用改善腦代謝藥物如ATP40 mg、輔酶A 100 U、胞二磷膽堿0.75 g,每日1次,連用10天。腦水腫嚴(yán)重者給20%甘露醇250 ml,每日2～4次靜滴。

針刺取穴:前神聰透懸厘穴(病灶側(cè)),百會(huì)透曲鬢穴(雙側(cè))。

針刺方法:常規(guī)消毒后,用0.40 mm×50 mm毫針,按上述穴區(qū)分3段透刺,針體與皮膚呈15度角,至帽狀腱膜下,深約40 mm。針后捻轉(zhuǎn)200次/min,每根針捻轉(zhuǎn)2 min,留針8 h。其間,開(kāi)始每隔30 min捻轉(zhuǎn)1次,重復(fù)2次,然后每2 h捻轉(zhuǎn)1次,直至出針。每日1次,10次為一療程。

溶栓治療組A2:包括B1、B2兩組,入院后先檢測(cè)指標(biāo),然后開(kāi)始靜脈溶栓(方法同A1組)。

常規(guī)治療組A3:包括B1、B2兩組,入院后先檢測(cè)指標(biāo),然后開(kāi)始常規(guī)治療。

口服:維生素C、維生素E、腸溶阿斯匹林,劑量同A1組。靜脈點(diǎn)滴精制蝮蛇抗栓酶2.0 U加入0.85%NaCl 250 ml,每日1次,連用10天。然后改用能量合劑(ATP)40 mg、輔酶A 100 U、胞二磷膽堿0.75 g,每日1次,用法同前。重證處理同前。

針刺常規(guī)治療對(duì)照組A4:包含B1、B2兩組,入院后即針刺(方法同A1組),同時(shí)檢測(cè)指標(biāo),然后進(jìn)行常規(guī)治療(同A3組)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

由于本題采用系統(tǒng)分析方法進(jìn)行分組,因此,所測(cè)各項(xiàng)定量指標(biāo)均值采用系統(tǒng)方差分析,并進(jìn)行兩兩組間對(duì)比。因需要在不同時(shí)間點(diǎn)上測(cè)得某指標(biāo),以觀(guān)察針刺在溶栓灌注各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的作用,則用具有一個(gè)重復(fù)測(cè)量的多因素方差分析。以上各種分析均用美國(guó)SAS公司的數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件包(6.12版)在686PC機(jī)上進(jìn)行。

2結(jié)果

血漿D-二聚體的正常參考值,各家報(bào)道不一。本題測(cè)值如表1。由此可知,隨著年齡的增高,D-二聚體也逐漸偏高,體內(nèi)處于相對(duì)高凝狀態(tài),這與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致。觀(guān)察組結(jié)果見(jiàn)表2～表5。

以上表明:本題所研究的D-二聚體范圍,如表1、表5所示。

治療前、后所有病人的D-二聚體值均高于正常參考值,兩兩相比,差異有非常顯著性意義(P<0.001),而發(fā)病在24 h以?xún)?nèi)未經(jīng)任何藥物處理的各組D-二聚體均值相比,差異無(wú)顯著性意義(P>0.05),見(jiàn)表4,說(shuō)明B1、B2各組間具有可比性。

針刺溶栓組與溶栓組的D-二聚體在溶栓5 h后,與治療前相比增高非常顯著(P<0.001)。其中,早期針刺溶栓組較早期溶栓組高,針刺溶栓組較溶栓組高(P<0.05)。提示針刺有可能使患者機(jī)體早期處于纖溶亢進(jìn)狀態(tài),從而加速溶栓進(jìn)程;與此同時(shí),常規(guī)治療組與針刺常規(guī)治療組的D-二聚體變化與治療前相比,差異無(wú)明顯意義(P>0.05)。提示常規(guī)藥物不具有纖溶作用,針刺也起不到纖溶作用,機(jī)體仍然維持急性期的相對(duì)高凝狀態(tài)。當(dāng)?shù)?次用藥后,即T₂時(shí)間點(diǎn)上,測(cè)定D-二聚體的值,針刺溶栓組(A1B1、A1B2)、溶栓組(A2B1、A2B2)基本維持現(xiàn)狀,且持續(xù)到第3天(T₃);此時(shí)常規(guī)治療組(A3B1、A3B2)、針刺常規(guī)治療組(A4B1、A4B2)D-二聚體均值與T₁比較方有上升趨勢(shì)(P<0.05)。但與針刺溶栓組、溶栓組相比仍有顯著差異(P<0.05),這種狀態(tài)一直持續(xù)到1周后(T₄)提示機(jī)體有可能處于自溶狀態(tài)。當(dāng)一周后測(cè)量D-二聚體時(shí),針刺溶栓組與溶栓組的均值較前次測(cè)量結(jié)果明顯下降(P<0.05)。第4周測(cè)得的結(jié)果較前2次雖有明顯差異(P<0.05),且有接近正常參考值趨勢(shì),但與正常參考值比較,差異仍有顯著意義(P<0.01)。常規(guī)治療組與針刺常規(guī)治療組從第2周起開(kāi)始下降,與T₃比較差異有顯著性意義(P<0.05),4周后測(cè)量仍呈下降趨勢(shì),與T₄比較P值小于0.05。

3討論

D-二聚體(D-dimer)是纖維蛋白單體(fibrin monomer)經(jīng)活化因子ⅩⅢ(F ⅩⅢa)交聯(lián)后,再經(jīng)纖溶酶(Plasmin)水解所產(chǎn)生的一種特異降解產(chǎn)物。利用Latex和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法,可以分別定性和定量測(cè)血漿和尿液中D-二聚體的含量。定性陽(yáng)性或定量增高反映纖溶活性增強(qiáng)和凝血酶生成增多,是一項(xiàng)鑒別原發(fā)性纖溶和繼發(fā)性纖溶以及監(jiān)測(cè)溶栓治療的較有價(jià)值的指標(biāo)。在凝血過(guò)程中,凝血酶水解纖維蛋白原先后釋放出纖維蛋白肽A(FPA)和肽B(FPB),剩余部分為可溶性纖維蛋白單體(SFM),在因子ⅩⅢa作用下,SFM轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白,從而血液凝固。此過(guò)程是因子ⅩⅢa(轉(zhuǎn)谷酰胺酶)在谷氨酸(397)與賴(lài)氨酸(405)處形成ε-(γ-谷氨酸-賴(lài)氨酸)交聯(lián)。這種交聯(lián)首先發(fā)生于兩條端與端聚合的纖維蛋白單體的γ鏈之間,其次發(fā)生于α鏈和α鏈之間,然后才發(fā)生在γ-α鏈之間。通過(guò)上述交聯(lián)后所形成的纖維蛋白很穩(wěn)定,一般不再溶解。纖溶酶除了可以降解纖維蛋白原和SFM外,也可降解交聯(lián)的纖維蛋白。交聯(lián)纖維蛋白在纖溶酶的降解過(guò)程中,逐漸生成X′、Y′、D和E′碎片以及DD、DD/E、YD/DY和YY/DD等多聚體,其中最簡(jiǎn)單的降解產(chǎn)物是D-二聚體和DD/E復(fù)合體。血漿D-二聚體作為交聯(lián)纖維蛋白的特異降解產(chǎn)物,其水平的增高反映繼發(fā)性纖溶活性的增強(qiáng),可作為體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)的分子標(biāo)志物之一。因此,它對(duì)高凝狀態(tài)和血栓性疾病的診斷、療效觀(guān)察和預(yù)后判斷有重要意義。

血漿D-二聚體作為交聯(lián)纖維蛋白的特異降解產(chǎn)物,其水平的增高與否,直接反映著繼發(fā)纖溶活性的狀況,是體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)的特異性指標(biāo)之一。

以往的實(shí)驗(yàn)提示,D-二聚體在應(yīng)用藥物后,一般5 h方達(dá)到高峰。選擇治療后5 h為觀(guān)測(cè)點(diǎn)。

血漿D-二聚體的水平在腦血管疾病時(shí)變化不一。Greenberg等報(bào)道,在急性缺血性中風(fēng)發(fā)病1周內(nèi),血漿D-二聚體水平略有升高,2周后則持續(xù)增高。Ono等人發(fā)現(xiàn),血漿D-二聚體的水平與年齡有關(guān),大于75歲(含75歲)的中風(fēng)患者與正常對(duì)照組比較差異顯著,而低年齡組中風(fēng)患者則差異不明顯。本題測(cè)定107例腦血管疾病患者的血漿D-二聚體水平,較正常對(duì)照組有明顯升高(P<0.001)。然而,無(wú)論腦梗塞的急性期還是恢復(fù)期,均較正常對(duì)照組差異有顯著意義(〖WTBX〗P〖WTBZ〗<0.001)。并且腦梗塞的急性期和恢復(fù)期均較健康老年人組明顯升高(P<0.001),這與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

4結(jié)論

(1)本題之所以選擇D-二聚體作為溶栓的特異性指標(biāo)是因?yàn)槟蚣っ改芗せ罾w溶酶原,使纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白溶解酶,后者可使交聯(lián)纖維蛋白降解,產(chǎn)生纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP),從而溶解血栓。然而,纖維蛋白溶解酶除了使纖維蛋白降解外,還可使纖維蛋白原降解產(chǎn)生FDP,故此FDP升高并不一定表示有血栓的形成或溶解。交聯(lián)纖維蛋白特異性降解產(chǎn)物D-二聚體的檢測(cè)為血栓形成及溶栓療效的判斷解決了難題。從本題檢測(cè)結(jié)果可知D-二聚體含量的多少對(duì)針刺加溶栓療效的判定有重要意義。

(2)本題研究還表明:早期溶栓+針刺組中各項(xiàng)指標(biāo)的改善程度均優(yōu)于本題中其它各組(P<0.05),其后依次早期溶栓組、針刺溶栓組、溶栓組(P<0.05),其中針刺溶栓組近期測(cè)值與溶栓組相比,差異無(wú)顯著性(P>0.05)。但遠(yuǎn)期觀(guān)測(cè),針刺溶栓組中各項(xiàng)指標(biāo)的改善程度高于溶栓組(P<0.05),表明頭穴透刺有助于溶栓,尤其是早期溶栓(12 h以?xún)?nèi))。針刺在尿激酶對(duì)血栓的溶解過(guò)程中起到很重要的作用,從某種意義上講,針刺拓寬了"治療時(shí)窗",從而為挽救"缺血性半暗帶"創(chuàng)造了有利條件;但針刺對(duì)"治療時(shí)窗"的拓寬也是有限制的,超過(guò)這一時(shí)限(12～24 h),針刺的這種作用則不甚明顯。另外,早期針刺組、針刺組、早期常規(guī)治療組、常規(guī)治療組中各項(xiàng)指標(biāo)的改善程度遠(yuǎn)不如溶栓療法的同一時(shí)間組(P<0.05)。結(jié)果同樣表明:早治療比晚治療效果顯著,針刺與常規(guī)治療配合發(fā)揮了一定的作用,但遠(yuǎn)不如與溶栓療法配合時(shí)作用明顯(P<0.05)。